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pCMV-Myc-PIASxβ重组质粒的构建与蛋白表达 被引量：3
1
作者 李江 张俊芳 +2 位作者 甄园丽 杨南扬 李晓萌 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第3期415-418,共4页
目的:通过基因重组方法构建pCMV-Myc-PIASxβ质粒,在真核细胞中高效表达重组蛋白并进行检测。方法:用SalⅠ和NotⅠ将PIASxβ片段从pGADT7载体中酶切后,利用DNA重组技术将其定向插入pCMV-Myc载体中。获得正确重组质粒后,瞬转CHO细胞系,用... 目的:通过基因重组方法构建pCMV-Myc-PIASxβ质粒,在真核细胞中高效表达重组蛋白并进行检测。方法:用SalⅠ和NotⅠ将PIASxβ片段从pGADT7载体中酶切后,利用DNA重组技术将其定向插入pCMV-Myc载体中。获得正确重组质粒后,瞬转CHO细胞系,用Western blotting检测Myc-PIASxβ重组融合蛋白表达。结果:经过酶切,片段回收,连接转化,获得重组质粒。重组pCMV-Myc-PIASxβ克隆通过酶切和测序鉴定其正确性。EcoRⅠ酶切鉴定,pCMV-Myc-PIASxβ为一条大小5 641 bp的条带;XbaⅠ酶切鉴定,pCMV-Myc-PIASXβ为2条大小分别为3 291和2 349 bp的条带,符合预计大小。Western blotting检测证实,在相对分子质量68 000处(PIASxβ融合蛋白)有特异的蛋白表达条带,与重组质粒相符。结论:成功构建了pCMV-Myc-PIASxβ重组质粒,为深入研究PIAS家族的功能奠定良好的基础。 展开更多
关键词 PIASxβ pCMV—Myc载体 重组质粒 基因表达
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PIAS3的Myc融合蛋白真核表达重组质粒的构建
2
作者 李江 甄园丽 +3 位作者 杨南扬 张俊芳 王中南 李晓萌 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2009年第2期201-204,共4页
目的:构建PIAS3(活化型STAT3抑制蛋白)的Myc融合蛋白真核表达重组质粒,并表达融合蛋白Myc-PIAS3。方法:采用PCR方法,扩增鼠PIAS3基因全长cDNA编码区序列。将该1851bp的特异性片段连接到T载体上,将其亚克隆至pCMV-Myc真核表达载体的SalⅠ... 目的:构建PIAS3(活化型STAT3抑制蛋白)的Myc融合蛋白真核表达重组质粒,并表达融合蛋白Myc-PIAS3。方法:采用PCR方法,扩增鼠PIAS3基因全长cDNA编码区序列。将该1851bp的特异性片段连接到T载体上,将其亚克隆至pCMV-Myc真核表达载体的SalⅠ和NotⅠ位点之间。将pCMV-Myc-PIAS3重组质粒转染前列腺癌PC3细胞,利用Myc抗体通过Western blotting法检测融合蛋白Myc-PIAS3的表达。结果:重组pCMV-Myc-PIAS3质粒通过酶切和测序鉴定了其正确性。EcoRⅠ酶切鉴定时有4357和1318bp2条带,XbaⅠ酶切鉴定时有3291bp和2384bp2条带,与预期结果一致。测序结果显示,13个氨基酸Myc在N端,然后是阅读框架正确的PIAS3的基因序列。pCMV-Myc-PIAS3重组质粒转染PC3细胞,利用Myc抗体通过Western blotting法检测融合蛋白Myc-PIAS3的表达,在相对分子质量68000处检测到特异的蛋白表达条带。结论:成功构建pCMV-Myc-PIAS3重组质粒,并表达融合蛋白Myc-PIAS3。 展开更多
关键词 PIAS3 Myc融合蛋白 重组质粒
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类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白表达载体的构建及表达
3
作者 杨南扬 缪璇 +3 位作者 伍贤军 刘金美 辻一郎 李晓萌 《吉林大学学报（医学版）》 CAS CSCD 北大核心 2011年第6期1010-1014,共5页
目的:构建pGEX-4T-1/SUMO3重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达和纯化出类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白。方法:采用PCR技术利用pcDNA3.1-SUMO3质粒为模板,扩增出SUMO3全长编码序列(312bp),并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白... 目的:构建pGEX-4T-1/SUMO3重组表达质粒,并在大肠杆菌中表达和纯化出类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白。方法:采用PCR技术利用pcDNA3.1-SUMO3质粒为模板,扩增出SUMO3全长编码序列(312bp),并将其重组于谷胱甘肽硫转移酶(GST)融合蛋白表达质粒pGEX-4T-1中,酶切、测序鉴定获得重组质粒。将重组质粒转化E.coli BL21,异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导产生GST-SUMO3的融合蛋白,并纯化获得相对分子质量为38 000的融合蛋白。结果:通过BamHⅠ和XhoⅠ双酶切,确定了重组质粒pGEX-4T-1/SUMO3中包含有312bp的小片段,并测序鉴定该插入片段序列与SUMO3序列一致;在终浓度为0.1mmol·L-1的IPTG诱导时,GST-SUMO3的融合蛋白也被成功地表达和纯化。结论:成功地制备和纯化了类泛素化修饰蛋白SUMO3/GST融合蛋白,为SUMO3多克隆抗体的制备提供了抗原基础,同时也为SUMO3及SUMO第二类家族功能的深入研究提供了保证。 展开更多
关键词 类泛素化蛋白3 GST融合蛋白 蛋白纯化
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