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信息素脂蛋白PplA对单核细胞增生性李斯特菌运动性和生物被膜形成调控的研究
1
作者
杜小栩
陈绵绵
+5 位作者
任耿佳
杨立锋
丁强
宋厚辉
江玲丽
孙静
《中国预防兽医学报》
2025年第7期667-675,共9页
为研究单核细胞增生性李斯特菌(LM)脂蛋白PplA在细菌运动、鞭毛形成和生物被膜(BF)形成中的调控作用,本研究从LM野生株EGD-e中扩增pplA基因的上下游片段分别克隆至pKSV7载体中构建pplA基因缺失重组质粒并采用PCR与测序鉴定;以EGD-e为模...
为研究单核细胞增生性李斯特菌(LM)脂蛋白PplA在细菌运动、鞭毛形成和生物被膜(BF)形成中的调控作用,本研究从LM野生株EGD-e中扩增pplA基因的上下游片段分别克隆至pKSV7载体中构建pplA基因缺失重组质粒并采用PCR与测序鉴定;以EGD-e为模板扩增pplA基因及其启动子片段,分别克隆至pIMK2质粒中构建pplA基因回补质粒并经PCR与测序鉴定。将缺失重组质粒转化EGD-e感受态细胞并利用双重压力(42℃、氯霉素抗性)使重组质粒中的同源臂序列与LM基因组发生交换,获得携带缺失重组质粒的pplA基因缺失菌株后,在30℃无抗环境下传代培养使缺失重组质粒丢失,以获得缺失株(ΔpplA)并经PCR与测序鉴定;将回补质粒转化ΔpplA感受态细胞,利用卡那霉素抗性培养基筛选得到回补株(CΔpplA)并经PCR与测序鉴定。在37℃和30℃分别培养各菌株,每隔1 h测定各菌株菌液的OD_(600nm)值,共测12 h以绘制各菌株的生长曲线,同时对各菌株点板计数,结果显示,PplA不影响LM的体外生长能力。将各菌株菌液接种于TSA半固体培养基,培养至24 h和48 h时检测细菌运动圈大小,结果显示,与野生菌株和回补株相比,ΔpplA株运动圈直径极显著和显著增大(P<0.01、P<0.05)。采用RT-qPCR方法检测野生株与ΔpplA株中鞭毛相关基因(flgB、flgC、flgD、flgE、flgG、flgK、flgL、mogR、gmaR、flhA、flhB、flaA、fliD、fliE、fliF、fliG、fliH、fliI、fliM、fliP、fliQ、fliR、mot B)的转录水平。结果显示,与野生株相比,ΔpplA株鞭毛相关基因的转录水平显著提高,其中flhB、fliF、flgD和flgE基因转录水平的变化最显著。在4℃、25℃以及37℃条件下静置培养EGD-e、ΔpplA及CΔpplA株,通过结晶紫法中的酶标仪检测法和显微镜观察法分别检测BF的形成量和BF结构的变化。结果显示,在4℃和25℃条件下,ΔpplA株BF的形成量显著和极显著低于野生株和回补株(P<0.05、P<0.001),而在37℃时,ΔpplA株BF的形成量极显著高于野生株和回补株(P<0.01)。在4℃和25℃条件下,ΔpplA株的BF结构较野生株和回补株更为疏松,而在37℃条件下,ΔpplA株BF的结构较野生株和回补株最为紧密。以上结果表明,LM信息素脂蛋白PplA不影响细菌的体外生长能力,但可以通过调控鞭毛相关基因的转录水平抑制细菌的体外运动能力,并通过鞭毛的形成影响LMBF的形成能力。本研究为探究LM通过PplA调控鞭毛形成相关基因的表达以适应外界和宿主环境的分子机制提供数据参考。
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关键词
单核细胞增生性李斯特菌
信息素脂蛋白PplA
运动性
鞭毛基因转录
生物被膜形成
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职称材料
题名
信息素脂蛋白PplA对单核细胞增生性李斯特菌运动性和生物被膜形成调控的研究
1
作者
杜小栩
陈绵绵
任耿佳
杨立锋
丁强
宋厚辉
江玲丽
孙静
机构
浙江农林大学动物医学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/同一健康和食品安全“一带一路”国际联合实验室/中澳动物健康大数据分析联合实验室
出处
《中国预防兽医学报》
2025年第7期667-675,共9页
基金
浙江省自然科学基金(LY23C180002、LY19C180001)
宁波市公益类科技项目(2022S006)
宁波市自然科学基金一般项目(2023J241)。
文摘
为研究单核细胞增生性李斯特菌(LM)脂蛋白PplA在细菌运动、鞭毛形成和生物被膜(BF)形成中的调控作用,本研究从LM野生株EGD-e中扩增pplA基因的上下游片段分别克隆至pKSV7载体中构建pplA基因缺失重组质粒并采用PCR与测序鉴定;以EGD-e为模板扩增pplA基因及其启动子片段,分别克隆至pIMK2质粒中构建pplA基因回补质粒并经PCR与测序鉴定。将缺失重组质粒转化EGD-e感受态细胞并利用双重压力(42℃、氯霉素抗性)使重组质粒中的同源臂序列与LM基因组发生交换,获得携带缺失重组质粒的pplA基因缺失菌株后,在30℃无抗环境下传代培养使缺失重组质粒丢失,以获得缺失株(ΔpplA)并经PCR与测序鉴定;将回补质粒转化ΔpplA感受态细胞,利用卡那霉素抗性培养基筛选得到回补株(CΔpplA)并经PCR与测序鉴定。在37℃和30℃分别培养各菌株,每隔1 h测定各菌株菌液的OD_(600nm)值,共测12 h以绘制各菌株的生长曲线,同时对各菌株点板计数,结果显示,PplA不影响LM的体外生长能力。将各菌株菌液接种于TSA半固体培养基,培养至24 h和48 h时检测细菌运动圈大小,结果显示,与野生菌株和回补株相比,ΔpplA株运动圈直径极显著和显著增大(P<0.01、P<0.05)。采用RT-qPCR方法检测野生株与ΔpplA株中鞭毛相关基因(flgB、flgC、flgD、flgE、flgG、flgK、flgL、mogR、gmaR、flhA、flhB、flaA、fliD、fliE、fliF、fliG、fliH、fliI、fliM、fliP、fliQ、fliR、mot B)的转录水平。结果显示,与野生株相比,ΔpplA株鞭毛相关基因的转录水平显著提高,其中flhB、fliF、flgD和flgE基因转录水平的变化最显著。在4℃、25℃以及37℃条件下静置培养EGD-e、ΔpplA及CΔpplA株,通过结晶紫法中的酶标仪检测法和显微镜观察法分别检测BF的形成量和BF结构的变化。结果显示,在4℃和25℃条件下,ΔpplA株BF的形成量显著和极显著低于野生株和回补株(P<0.05、P<0.001),而在37℃时,ΔpplA株BF的形成量极显著高于野生株和回补株(P<0.01)。在4℃和25℃条件下,ΔpplA株的BF结构较野生株和回补株更为疏松,而在37℃条件下,ΔpplA株BF的结构较野生株和回补株最为紧密。以上结果表明,LM信息素脂蛋白PplA不影响细菌的体外生长能力,但可以通过调控鞭毛相关基因的转录水平抑制细菌的体外运动能力,并通过鞭毛的形成影响LMBF的形成能力。本研究为探究LM通过PplA调控鞭毛形成相关基因的表达以适应外界和宿主环境的分子机制提供数据参考。
关键词
单核细胞增生性李斯特菌
信息素脂蛋白PplA
运动性
鞭毛基因转录
生物被膜形成
Keywords
Listeria monocytogenes
pheromone lipoprotein PplA
motility
flagellar gene transcription
biofilm formation
分类号
S852.61 [农业科学]
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题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
信息素脂蛋白PplA对单核细胞增生性李斯特菌运动性和生物被膜形成调控的研究
杜小栩
陈绵绵
任耿佳
杨立锋
丁强
宋厚辉
江玲丽
孙静
《中国预防兽医学报》
2025
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