目的·探究miR-185-5p在分枝杆菌感染的巨噬细胞中对自噬的调控作用和对胞内分枝杆菌生存的影响。方法·使用卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)感染人单核细胞白血病细胞(THP-1)诱导分化的巨噬细胞,通过超速离心法分...目的·探究miR-185-5p在分枝杆菌感染的巨噬细胞中对自噬的调控作用和对胞内分枝杆菌生存的影响。方法·使用卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)感染人单核细胞白血病细胞(THP-1)诱导分化的巨噬细胞,通过超速离心法分离细胞培养上清液中的外泌体;通过Western blotting、纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)、透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)分别对外泌体的表面标志蛋白、大小和形态进行鉴定,通过实时荧光定量PCR(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测BCG感染的巨噬细胞内及外泌体中miR-185-5p的表达水平。外泌体使用PKH26染料进行荧光染色并与巨噬细胞共培养,观察巨噬细胞对外泌体的吞噬情况。通过模拟物(mimic)和抑制剂(inhibitor)实现miR-185-5p在巨噬细胞内的过表达和抑制作用,通过菌落形成单位(colony-forming unit,CFU)实验验证miR-185-5p对巨噬细胞内BCG生长存活的影响。通过Western blotting检测自噬标志物微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)蛋白的表达,研究过表达、抑制miR-185-5p以及使用自噬抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)对巨噬细胞自噬的影响;进一步使用SensGFP-StubRFP-LC3自噬双荧光慢病毒检测miR-185-5p对自噬流的影响。使用TargetScan、miRDB和Starbase数据库对miR-185-5p的靶基因进行预测,并使用注释、可视化和综合发现数据库(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery,DAVID)工具进行基因本体(Gene Ontology,GO)分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)功能富集分析。结果·超速离心法成功分离出巨噬细胞外泌体,Western blotting成功检测到外泌体标志蛋白白细胞分化抗原9(cluster differentiation 9,CD9)、肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101,TSG101);通过TEM、NTA鉴定,外泌体为双层膜结构,直径约150 nm。BCG感染后,miR-185-5p在巨噬细胞内和外泌体中的表达均显著上调(P=0.000),且其在BCG感染的巨噬细胞内的表达水平呈时间依赖性升高。外泌体与巨噬细胞共培养,可被巨噬细胞吞噬。与mimic和inhibitor的各自对照相比,mimic显著上调miR-185-5p的表达(P=0.000),而inhibitor抑制miR-185-5p的表达(P=0.002)。使用mimic引起巨噬细胞内BCG的CFU数量显著增加(P=0.000),而inhibitor则使CFU数量减少(P=0.041)。BCG感染使巨噬细胞中LC3Ⅱ蛋白的表达上调,而mimic可降低LC3Ⅱ的表达,inhibitor可升高LC3Ⅱ的表达。在CQ作用下,使用inhibitor抑制miR-185-5p仍能显著增强巨噬细胞中LC3Ⅱ的表达。自噬流检测结果显示,相比于各自的对照组,mimic组自噬体的生成明显减少(P=0.034),而inhibitor组自噬体的生成明显增加(P=0.042)。通过靶基因预测以及GO和KEGG功能富集分析发现,miR-185-5p可能通过靶向核受体亚家族1组D成员1(nuclear receptor subfamily 1 group D member 1,NR1D1)、Ras相关蛋白Rab-35(Ras-related protein Rab-35,RAB35)、细胞分裂控制蛋白42同源物(cell division control protein 42 homolog,CDC42)等基因发挥自噬调节作用。结论·分枝杆菌感染诱导巨噬细胞内及外泌体中miR-185-5p表达上调,miR-185-5p通过抑制自噬体的生成抑制巨噬细胞的自噬过程,从而促进细胞内分枝杆菌的生长及存活。展开更多
为探索chac1基因(ChaC glutathione specific gamma-glutamylcyclotransferase 1)在早期胚胎发育中的功能,本研究以斑马鱼(Danio rerio)为研究对象首先分析了斑马鱼Chac1蛋白的序列特征并用qRT-PCR检测了chac1在斑马鱼胚胎不同发育阶段...为探索chac1基因(ChaC glutathione specific gamma-glutamylcyclotransferase 1)在早期胚胎发育中的功能,本研究以斑马鱼(Danio rerio)为研究对象首先分析了斑马鱼Chac1蛋白的序列特征并用qRT-PCR检测了chac1在斑马鱼胚胎不同发育阶段和成鱼不同组织中的表达模式,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在chac1基因的三个外显子上设计了3条sgRNA并通过测序及qRT-PCR检测其敲除效率。苏丹黑染色3 dpf(days post fertilization)野生型和chac1突变型斑马鱼幼鱼的中性粒细胞数量;qRT-PCR检测突变斑马鱼髓系造血相关因子。结果显示:chac1是母源基因,在受精后0~3 hpf(hours post fertilization)时其表达量较高,之后随着母本基因的影响逐渐变小,chac1的mRNA表达量下降;在斑马鱼成鱼中,其在肌肉、卵巢、脑中高表达;此外,突变型斑马鱼较野生型斑马鱼相比,其苏丹黑染色阳性信号更多;chac1突变后髓系造血转录调控因子pu.1的mRNA水平上调。综上,chac1为母源基因,其缺失会促进早期中性粒细胞的发育并伴随着髓系造血转录调控因子pu.1的上调。展开更多
文摘目的·探究miR-185-5p在分枝杆菌感染的巨噬细胞中对自噬的调控作用和对胞内分枝杆菌生存的影响。方法·使用卡介苗(Bacillus Calmette-Guérin,BCG)感染人单核细胞白血病细胞(THP-1)诱导分化的巨噬细胞,通过超速离心法分离细胞培养上清液中的外泌体;通过Western blotting、纳米颗粒跟踪分析(nanoparticle tracking analysis,NTA)、透射电子显微镜(transmission electron microscopy,TEM)分别对外泌体的表面标志蛋白、大小和形态进行鉴定,通过实时荧光定量PCR(quantitative polymerase chain reaction,qPCR)检测BCG感染的巨噬细胞内及外泌体中miR-185-5p的表达水平。外泌体使用PKH26染料进行荧光染色并与巨噬细胞共培养,观察巨噬细胞对外泌体的吞噬情况。通过模拟物(mimic)和抑制剂(inhibitor)实现miR-185-5p在巨噬细胞内的过表达和抑制作用,通过菌落形成单位(colony-forming unit,CFU)实验验证miR-185-5p对巨噬细胞内BCG生长存活的影响。通过Western blotting检测自噬标志物微管相关蛋白1轻链3(microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)蛋白的表达,研究过表达、抑制miR-185-5p以及使用自噬抑制剂氯喹(chloroquine,CQ)对巨噬细胞自噬的影响;进一步使用SensGFP-StubRFP-LC3自噬双荧光慢病毒检测miR-185-5p对自噬流的影响。使用TargetScan、miRDB和Starbase数据库对miR-185-5p的靶基因进行预测,并使用注释、可视化和综合发现数据库(Database for Annotation,Visualization and Integrated Discovery,DAVID)工具进行基因本体(Gene Ontology,GO)分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)功能富集分析。结果·超速离心法成功分离出巨噬细胞外泌体,Western blotting成功检测到外泌体标志蛋白白细胞分化抗原9(cluster differentiation 9,CD9)、肿瘤易感基因101(tumor susceptibility gene 101,TSG101);通过TEM、NTA鉴定,外泌体为双层膜结构,直径约150 nm。BCG感染后,miR-185-5p在巨噬细胞内和外泌体中的表达均显著上调(P=0.000),且其在BCG感染的巨噬细胞内的表达水平呈时间依赖性升高。外泌体与巨噬细胞共培养,可被巨噬细胞吞噬。与mimic和inhibitor的各自对照相比,mimic显著上调miR-185-5p的表达(P=0.000),而inhibitor抑制miR-185-5p的表达(P=0.002)。使用mimic引起巨噬细胞内BCG的CFU数量显著增加(P=0.000),而inhibitor则使CFU数量减少(P=0.041)。BCG感染使巨噬细胞中LC3Ⅱ蛋白的表达上调,而mimic可降低LC3Ⅱ的表达,inhibitor可升高LC3Ⅱ的表达。在CQ作用下,使用inhibitor抑制miR-185-5p仍能显著增强巨噬细胞中LC3Ⅱ的表达。自噬流检测结果显示,相比于各自的对照组,mimic组自噬体的生成明显减少(P=0.034),而inhibitor组自噬体的生成明显增加(P=0.042)。通过靶基因预测以及GO和KEGG功能富集分析发现,miR-185-5p可能通过靶向核受体亚家族1组D成员1(nuclear receptor subfamily 1 group D member 1,NR1D1)、Ras相关蛋白Rab-35(Ras-related protein Rab-35,RAB35)、细胞分裂控制蛋白42同源物(cell division control protein 42 homolog,CDC42)等基因发挥自噬调节作用。结论·分枝杆菌感染诱导巨噬细胞内及外泌体中miR-185-5p表达上调,miR-185-5p通过抑制自噬体的生成抑制巨噬细胞的自噬过程,从而促进细胞内分枝杆菌的生长及存活。
文摘为探索chac1基因(ChaC glutathione specific gamma-glutamylcyclotransferase 1)在早期胚胎发育中的功能,本研究以斑马鱼(Danio rerio)为研究对象首先分析了斑马鱼Chac1蛋白的序列特征并用qRT-PCR检测了chac1在斑马鱼胚胎不同发育阶段和成鱼不同组织中的表达模式,通过CRISPR/Cas9基因编辑技术在chac1基因的三个外显子上设计了3条sgRNA并通过测序及qRT-PCR检测其敲除效率。苏丹黑染色3 dpf(days post fertilization)野生型和chac1突变型斑马鱼幼鱼的中性粒细胞数量;qRT-PCR检测突变斑马鱼髓系造血相关因子。结果显示:chac1是母源基因,在受精后0~3 hpf(hours post fertilization)时其表达量较高,之后随着母本基因的影响逐渐变小,chac1的mRNA表达量下降;在斑马鱼成鱼中,其在肌肉、卵巢、脑中高表达;此外,突变型斑马鱼较野生型斑马鱼相比,其苏丹黑染色阳性信号更多;chac1突变后髓系造血转录调控因子pu.1的mRNA水平上调。综上,chac1为母源基因,其缺失会促进早期中性粒细胞的发育并伴随着髓系造血转录调控因子pu.1的上调。
