高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒N基因真核表达载体的构建及表达 被引量：2

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作者 廖立珊 曾少灵 +10 位作者 孙洁 杨俊兴 阮周曦 张彩虹 曹琛福 唐金明 叶奕优 吕建强 秦智锋 林庆燕 花群义 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第9期25-28,共4页

为进一步研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白的结构、功能及免疫学特性,提取PRRSV云南分离株A06RNA,设计特异性引物扩增全长N基因,得到长度为372bp的目的片段,克隆至杆状病毒Bac-To-Bac表达载体pFastBac HTB中,转化大肠埃... 为进一步研究高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)N蛋白的结构、功能及免疫学特性,提取PRRSV云南分离株A06RNA,设计特异性引物扩增全长N基因,得到长度为372bp的目的片段,克隆至杆状病毒Bac-To-Bac表达载体pFastBac HTB中,转化大肠埃希菌DH10Bac进行同源重组,成功构建了含有N基因的真核表达载体,转染Sf9细胞,回收得到重组杆状病毒。SDS-PAGE和Western blot检测结果表明,表达产物17ku,与预期大小一致,能与PRRSV阳性血清产生特异性反应。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 N基因 杆状病毒 表达

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猪繁殖与呼吸综合征病毒A06株单克隆抗体的制备及鉴定

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作者 廖立珊 詹爱军 +5 位作者 杨俊兴 曾少灵 花群义 余兴龙 秦智锋 林庆燕 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2009年第12期1-4,共4页

用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)A06株病毒抗原免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。经间接ELISA方法筛选,有限稀释法克隆,获得4株稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3D12、4E10、6E... 用纯化的猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)A06株病毒抗原免疫Balb/c小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行细胞融合。经间接ELISA方法筛选,有限稀释法克隆,获得4株稳定分泌特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株,分别命名为3D12、4E10、6E2和7G6。其细胞培养上清效价分别为1∶256、1∶512、1∶512和1∶256,小鼠腹水效价分别为1∶1.024×106、1∶2.048×106、1∶1.024×106和1∶2.048×106。亚型鉴定表明,3D12、4E10、6E2和7G6分别为IgG2b、IgG2b、IgG1和IgG2a。ELISA检测结果显示,4种PRRSV单克隆抗体仅与PRRSV反应,不与其他病毒反应,表明均为抗PRRSV的型特异性单克隆抗体。对单克隆抗体腹水液进行IgG提取纯化,SDS-PAGE电泳验证,仅出现两条清晰条带,无杂带出现,证明纯化效果较好。这4种单克隆抗体的获得,为建立PRRSV检测方法提供了强有力的工具。 展开更多

关键词 猪繁殖与呼吸综合征病毒 单克隆抗体 生物学特性

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非洲猪瘟病毒VP73蛋白在昆虫细胞中的表达与间接ELISA方法的建立 被引量：17

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作者 曾少灵 廖立珊 +11 位作者 唐金明 杨俊兴 阮周曦 张彩虹 曹琛福 吕建强 秦智锋 林庆燕 孙洁 叶弈优 谢晓露 花群义 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第1期1-6,共6页

为了建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)间接酶联免疫吸附试验(iELISA),利用杆状病毒表达载体pFastBac HTA在昆虫细胞Sf9中表达非洲猪瘟病毒的VP73蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测显示重组蛋白大小约65ku,能与ASFV标准阳性血清发生特异性结合... 为了建立检测非洲猪瘟病毒(ASFV)间接酶联免疫吸附试验(iELISA),利用杆状病毒表达载体pFastBac HTA在昆虫细胞Sf9中表达非洲猪瘟病毒的VP73蛋白,SDS-PAGE和Western blot检测显示重组蛋白大小约65ku,能与ASFV标准阳性血清发生特异性结合。以此重组蛋白作为检测抗原包被酶标板,初步建立了检测ASFV血清抗体的iELISA方法。表达的重组蛋白具有良好的特异性,为制备ASFV免疫血清学诊断检测试剂和疫苗提供了材料。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 VP73蛋白 间接ELISA

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实时荧光定量PCR检测畜禽肉制品中鸭源性成分 被引量：13

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作者 林彦星 张彩虹 +8 位作者 阮周曦 刘建利 宗卉 廖立珊 孙洁 杨俊兴 吕建强 花群义 曹琛福 《动物医学进展》 北大核心 2016年第11期48-53,共6页

根据鸭mtDNA COX基因上的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR用于检测畜禽肉制品中的鸭源性成分。结果表明,建立的方法特异性强,与鹅、鸡、羊、牛等15种动物DNA无非特异性扩增;灵敏度高,可检测1.0pg/μL鸭源DNA的... 根据鸭mtDNA COX基因上的保守序列设计特异性引物和TaqMan探针,建立实时荧光定量PCR用于检测畜禽肉制品中的鸭源性成分。结果表明,建立的方法特异性强,与鹅、鸡、羊、牛等15种动物DNA无非特异性扩增;灵敏度高,可检测1.0pg/μL鸭源DNA的存在;重复性好,同DNA浓度所测得Ct值的变异系数均小于3%;应用该法对模拟混合样品进行检测,结果与预期相符,且常见肉类DNA的存在并不影响该法对鸭源性成分检测的灵敏度。说明本试验建立的鸭源性成分实时荧光定量PCR法特异、敏感、稳定,可快速准确检测畜禽肉制品中含有的鸭源性成分。 展开更多

关键词 实时荧光定量PCR 检测 鸭源性成分

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引起猪腹泻的病毒分离鉴定 被引量：8

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作者 林庆燕 陈书琨 +14 位作者 孙洁 唐金明 陈兵 卢体康 刘建利 廖立珊 曾少灵 祁振强 阮周曦 吕建强 杨俊兴 曹琛福 张彩虹 花群义 秦智锋 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第10期75-79,共5页

为了对近年来引起仔猪腹泻的主要病毒进行分离鉴定,进而为疫苗的研发奠定基础,自2011年开始,从华南地区猪场连续3年检测出多个引起猪腹泻症状的病毒。其中2011年采用MA-104细胞系从临床样品小肠内容物中分离到猪流行性腹泻病毒(PEDV)和... 为了对近年来引起仔猪腹泻的主要病毒进行分离鉴定,进而为疫苗的研发奠定基础,自2011年开始,从华南地区猪场连续3年检测出多个引起猪腹泻症状的病毒。其中2011年采用MA-104细胞系从临床样品小肠内容物中分离到猪流行性腹泻病毒(PEDV)和猪轮状病毒A(PRoVA),临床样品为2种病毒的混合感染。2012年分离到PEDV、PRoVA和猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)3种病毒,临床样品为3种病毒混合感染。2013年从临床样品中只分离到PEDV 1种病毒。通过在Vero-76传代细胞系中前3代加入胰酶和猪胰酶,自第4代仅加入胰酶的方法,成功克服了PEDV的细胞毒性,实现了连续传代,并在第8代出现了细胞病变(CPE)。通过采用IgY抗体对PEDV和PRoVA混合感染的MA-104细胞培养液连续中和和传代,成功分离纯化到猪轮状病毒A。对9个猪场的3年猪腹泻病毒性疾病流行病学调查表明,2011年—2013年主要是以PED流行为主。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 分离纯化 流行病学调查

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鸡传染性法氏囊病病毒RT-PCR检测方法的建立与应用 被引量：5

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作者 孙洁 卢体康 +13 位作者 曾少灵 杨俊兴 詹爱军 林庆燕 曹琛福 陈兵 廖立珊 阮周曦 陶虹 张彩虹 刘建利 花群义 吕建强 秦智锋 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第12期6-10,共5页

鸡传染性法氏囊病(IBD)是危害我国养禽业的主要疫病之一,呈世界性分布,对养鸡业造成重大危害。在国际种禽贸易中,对IBDV检测是口岸检疫的主要对象之一。为了建立标准的鸡传染性法氏囊病病毒分子检测方法,采用世界动物卫生组织(OIE)推荐... 鸡传染性法氏囊病(IBD)是危害我国养禽业的主要疫病之一,呈世界性分布,对养鸡业造成重大危害。在国际种禽贸易中,对IBDV检测是口岸检疫的主要对象之一。为了建立标准的鸡传染性法氏囊病病毒分子检测方法,采用世界动物卫生组织(OIE)推荐的带有通用引物和酶切位点的特异性引物,通过对6株不同毒株的反复试验,优化了针对A片段VP2基因的常规反转录-聚合酶链反应(RT-PCR)检测方法 (IBDV-VP2(604)-RT-PCR)和针对B片段VP1基因的RT-PCR检测方法(IBDV-VP1(642)-RT-PCR);针对A片段VP2基因设计特异性引物和探针,建立了优化IBDV特异性实时荧光定量反转录-聚合酶链反应(rRT-PCR)检测方法(IBDV-VP2-rRT-PCR)。将传染性法氏囊病疫苗-法倍灵(IBDV-BLEN)疫苗株进行系列稀释,两种RT-PCR检测方法的灵敏度均为10-3,而IBDV-VP2-rRT-PCR检测方法灵敏度为10-4。所建立的三种分子生物学检测方法特异,与其他家禽病毒无任何交叉反应。通过对自2007年以来18批221份田间样品检测表明,所建立的方法准确可靠,适合对鸡传染性法氏囊病病毒进行快速灵敏检测和监测。 展开更多

关键词 传染性法氏囊病 常规RT-PCR 实时荧光定量RT-PCR 快速检测

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产CTX-M和TEM型ESBLs耐药大肠埃希菌双重PCR检测方法的建立 被引量：6

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作者 陶虹 卢体康 +13 位作者 唐金明 廖立珊 阮周曦 刘建利 曾少灵 陈兵 胡运发 孙洁 曹琛福 张彩虹 吕建强 杨俊兴 花群义 秦智锋 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2013年第8期7-12,共6页

近年来,由于抗生素滥用导致细菌产生耐药性的现象已经非常严重,而产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌耐药菌株的出现,已成为目前出入境食品安全检测的重点和难点。耐药大肠埃希菌ESBLs基因型有5种,其中产CTX-M和TEM两种基因型最为普... 近年来,由于抗生素滥用导致细菌产生耐药性的现象已经非常严重,而产超广谱β-内酰胺酶(ESBLs)大肠埃希菌耐药菌株的出现,已成为目前出入境食品安全检测的重点和难点。耐药大肠埃希菌ESBLs基因型有5种,其中产CTX-M和TEM两种基因型最为普遍。为了加强对产CTX-M和TEM两种基因型ESBLs耐药大肠埃希菌的检测,本研究在反复优化的基础上,建立了针对产CTX-M和TEM两种基因型ESBLs大肠埃希菌的快速检测方法。针对CTX-M基因型的PCR方法检测CTX-M ESBLs型的灵敏度为10-5,针对TEM基因型的PCR方法检测TEM ESBLs型的灵敏度为10-4,双重PCR方法检测对应基因型ESBLs灵敏度均为10-4。该方法特异性好,尚未发现假阴性和假阳性现象。采用建立的方法与VITEK-2细菌鉴定系统的鉴定方法和NCCLSM100-S10推荐的检测方法同时对623份样品进行检测并比较,结果表明,共检出只含CTX-M型ESBLs的耐药菌株13株,检出只含TEM基因型ESBLs的耐药菌株1株,同时含有CTX-M和TEM两种基因型ESBLs的耐药菌株9株,检测结果与细菌分离鉴定结果一致。表明所建立的方法可为产ESBLs大肠埃希菌的快速准确检测提供有效的工具,能够满足产ESBLs大肠埃希菌快速、准确、有效的口岸检疫需求。 展开更多

关键词 超广谱Β-内酰胺酶 耐药性 快速检测

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小反刍兽疫病毒N蛋白B细胞表位预测、合成及间接ELISA方法的建立 被引量：5

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作者 曾少灵 阮周曦 +10 位作者 唐金明 廖立珊 孙洁 林庆燕 吕建强 叶奕优 祝贺 李希强 王红英 杨俊兴 花群义 《动物医学进展》 北大核心 2015年第8期40-44,共5页

基于氨基酸序列和采用Gamier-Robson和Chou-Fasman等多种方法分析的α-螺旋、β-折叠和转角等二级结构结果,预测小反刍兽疫病毒N蛋白的B细胞抗原表位。设计4段多肽并进行人工合成,作为包被抗原建立小反刍兽疫血清抗体间接ELISA检测方法... 基于氨基酸序列和采用Gamier-Robson和Chou-Fasman等多种方法分析的α-螺旋、β-折叠和转角等二级结构结果,预测小反刍兽疫病毒N蛋白的B细胞抗原表位。设计4段多肽并进行人工合成,作为包被抗原建立小反刍兽疫血清抗体间接ELISA检测方法,用于检测小反刍兽疫山羊临床血清样品,以对预测的B细胞抗原表位进行验证。结果显示,研制的间接ELISA敏感性为96.0%,特异性为96.25%,与进口标准竞争ELISA试剂盒的符合率为96.15%。结果表明,研制的间接ELISA方法适用于小反刍兽疫临床血清抗体的检测。 展开更多

关键词 小反刍兽疫病毒 N蛋白 B细胞表位 酶联免疫吸附试验

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猪流行性腹泻病毒分离鉴定与实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立 被引量：5

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作者 唐金明 陈书琨 +14 位作者 林庆燕 黄新亚 卢体康 孙洁 阮周曦 曾少灵 祁振强 吕建强 杨俊兴 曹琛福 张彩虹 刘建利 廖立珊 花群义 秦智锋 《动物医学进展》 CSCD 北大核心 2014年第8期31-35,共5页

采用Vero-76细胞系从临床样品小肠内容物中分离到1株猪流行性腹泻病毒(PEDV),通过RT-PCR进行了鉴定。针对PEDV,参照保守的M基因序列设计了特异性引物和探针,建立了针对PEDV特异性的实时荧光定量RT-PCR检测方法(PEDV-rRT-PCR)。所建立的... 采用Vero-76细胞系从临床样品小肠内容物中分离到1株猪流行性腹泻病毒(PEDV),通过RT-PCR进行了鉴定。针对PEDV,参照保守的M基因序列设计了特异性引物和探针,建立了针对PEDV特异性的实时荧光定量RT-PCR检测方法(PEDV-rRT-PCR)。所建立的方法特异性强,与传染性胃肠炎病毒、轮状病毒、猪细小病毒等猪主要病原体无交叉反应;方法灵敏度高,检测灵敏度达到重组质粒10-8稀释度(约20cop);重复性好,组内变异系数≤0.26%。20份田间样品检测结果表明,所建立的PEDV-rRTPCR方法快速、灵敏,检测结果准确可靠,适合用于PEDV的快速检测和流行病学调查。 展开更多

关键词 猪流行性腹泻病毒 病毒分离 实时荧光定量RT-PCR

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非洲猪瘟病毒p72蛋白的真核表达及反应原性鉴定 被引量：2

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作者 梁云浩 曹琛福 +8 位作者 叶奕优 花群义 张彩虹 曾少灵 陶虹 廖立珊 刘建利 唐勇 吕建强 《动物医学进展》 北大核心 2015年第6期29-33,共5页

将p72基因克隆到载体pFast Bac/NT-TOPO上,转化大肠埃希菌DH5α。将获得的重组载体pFastBac/NT-TOPO-p72,转化大肠埃希菌DH10Bac,获得重组杆状病毒质粒bacmid-p72。通过脂质体介导,将bacmid-p72转染sf9细胞,获得重组杆状病毒。用重组杆... 将p72基因克隆到载体pFast Bac/NT-TOPO上,转化大肠埃希菌DH5α。将获得的重组载体pFastBac/NT-TOPO-p72,转化大肠埃希菌DH10Bac,获得重组杆状病毒质粒bacmid-p72。通过脂质体介导,将bacmid-p72转染sf9细胞,获得重组杆状病毒。用重组杆状病毒感染正常生长的sf9细胞,72h后收集细胞,超声破碎后取上清进行SDS-PAGE和Western blot分析。结果显示,重组蛋白大小约78ku,且重组蛋白可以与非洲猪瘟标准阳性血清反应。说明表达的重组蛋白为可溶性的,并具有良好的反应原性。 展开更多

关键词 非洲猪瘟病毒 p72蛋白 脂质体介导 重组杆状病毒

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世界动物卫生组织One Health总体框架及最新关注方向

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作者 耿庆华 廖立珊 +4 位作者 李修平 林茜茜 吴江 孙洁 刘荭 《动物医学进展》 北大核心 2024年第4期121-125,共5页

近年来,人兽共患病在全球越来越多的地方影响人类和动物的健康。在此背景下,由联合国粮食及农业组织(FAO)、世界卫生组织(WHO)和世界动物卫生组织(WOAH)三方国际组织提出了“One Health”的概念。2021年底,FAO、WOAH、WHO和联合国环境... 近年来,人兽共患病在全球越来越多的地方影响人类和动物的健康。在此背景下,由联合国粮食及农业组织(FAO)、世界卫生组织(WHO)和世界动物卫生组织(WOAH)三方国际组织提出了“One Health”的概念。2021年底,FAO、WOAH、WHO和联合国环境规划署(UNEP)共同成立了One Health高级别委员会(One Health High Level Expert Panel,OHHLEP),并将“One Health”重新定义。论文就“One Health”的概念、提出的背景、重要发展进程、总体框架和协调机制以及未来应用展望进行了全面的介绍和阐述,为我国进一步深入了解“One Health”理念,实践并更好地应用“One Health”方法,从而解决我国人兽共患病、抗生素耐药等对人类、动物和环境危害严重的问题提供思路和参考。 展开更多

关键词 One health 发展进程 总体框架 协调机制 未来应用

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感染唐鱼的草鱼呼肠孤病毒分离与鉴定

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作者 吴江 赵现锋 +7 位作者 陈兵 安微 孙洁 林彦星 王津津 廖立珊 赵永刚 兰文升 《中国动物检疫》 CAS 2023年第6期31-37,共7页

广东省某渔场待出境送检唐鱼(Tanichthys albonubes)样品,经病理检查未发现临床症状,取样品的肝、脾和肾等器官组织,用细胞分离培养方法检测病毒性因子,发现该批次唐鱼样品的组织提取物能够造成EPC和CHSE-214细胞发生细胞病变效应(CPE)... 广东省某渔场待出境送检唐鱼(Tanichthys albonubes)样品,经病理检查未发现临床症状,取样品的肝、脾和肾等器官组织,用细胞分离培养方法检测病毒性因子,发现该批次唐鱼样品的组织提取物能够造成EPC和CHSE-214细胞发生细胞病变效应(CPE),确定该样品携带病毒性病原。为探究唐鱼携带病原的种类,针对草鱼呼肠孤病毒(GCRV)S9核酸片段设计特异性引物,对产生CPE的细胞培养物进行RT-PCR核酸扩增和序列测定,用EPC细胞扩增该病毒,获得病毒含量为10^(6.25)TCID_(50)/mL的细胞培养物,通过高通量测序技术分析细胞培养物中的病毒类型,并用不同病毒含量的细胞培养物进行唐鱼感染性试验。测序结果经BLAST比对分析发现,扩增序列与GCRV 873株的S9核苷酸序列同源性达98%,鉴定病原为GCRV,将其命名为GCRV SZ0508株。全基因组测序序列注释为GCRV,通过vp2基因遗传进化分析发现,GCRV SZ0508属于I型GCRV。感染性试验中,感染组100%被感染,死亡率为3.3%,表明分离的GCRV能够感染唐鱼,具有造成唐鱼发生草鱼出血病的风险。 展开更多

关键词 唐鱼 草鱼呼肠孤病毒 Illumina高通量测序技术

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