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单增李斯特菌PTS系统转运蛋白IIB^(man)介导运动性和感染的功能研究
被引量：
2
1
作者
张佳雪
陈绵绵
+7 位作者
程丽丽
任耿佳
徐像文
鲁珂蓥
庄楠茜
孙静
宋厚辉
程昌勇
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第11期1179-1187,共9页
为探究单增李斯特菌(LM)磷酸转移酶系统(PTS)转运蛋白IIB^(man)在LM生长、运动性及其生物学功能,本研究以LM EGD-e株基因组为模板,经PCR扩增iiB^(man)基因的上下游基因片段(不包含iiB^(man)基因),插入质粒pKSV7以构建缺失质粒;以LM EGD-...
为探究单增李斯特菌(LM)磷酸转移酶系统(PTS)转运蛋白IIB^(man)在LM生长、运动性及其生物学功能,本研究以LM EGD-e株基因组为模板,经PCR扩增iiB^(man)基因的上下游基因片段(不包含iiB^(man)基因),插入质粒pKSV7以构建缺失质粒;以LM EGD-e基因组为模板,采用PCR扩增iiB^(man)基因与启动子片段,插入质粒pIMK2以构建回补质粒,经PCR和测序鉴定后,将缺失质粒转化LM EGD-e感受态细胞,通过氯霉素抗性及42℃压力下使重组质粒与LM EGD-e株的同源片段发生同源重组单交换获得一代同源重组菌株,然后在无抗性培养基中30℃培养使质粒丢失,获得缺失株ΔiiB^(man)。将回补质粒转化ΔiiB^(man)感受态细胞中,通过卡那霉素抗性筛选获得回补株CΔiiB^(man),缺失株和回补株均经PCR和测序鉴定。37℃培养EGD-e、ΔiiB^(man)、CΔiiB^(man)12 h,期间每隔1 h测定OD_(600nm)并绘制生长曲线,分析各菌株生长特性,结果显示,各菌株体外生长趋势相似。将各菌株菌液接种于TSA半固体培养基,培养至24 h和48 h时检测细菌运动圈大小,结果显示ΔiiB^(man)的运动圈直径分别是EGD-e的1.5及1.6倍(P<0.05、P<0.01),CΔiiB^(man)与EGD-e运动圈直径均基本一致。在各菌株培养上清中加入绵羊血,检测各菌株溶血能力,结果显示,ΔiiB^(man)的溶血能力较EGD-e及CΔiiB^(man)增强。将各菌株以MOI 20感染RAW264.7细胞,在感染后2 h、5 h和8 h收集细胞进行点样计数,结果显示,在感染后2 h和5 h时ΔiiB^(man)的胞内增殖能力较EGD-e及CΔiiB^(man)显著增强(P<0.05)。将各菌株以2×10^(5)cfu/只经腹腔注射感染小鼠48 h后剖杀,取肝脏和脾脏研磨并点样计数,结果显示,ΔiiB^(man)在小鼠脏器载菌量较EGD-e及CΔiiB^(man)极显著增多(P<0.001)。上述结果首次表明IIB^(man)不影响LM的生长,但影响LM的运动性及提高LM的体外溶血活性;IIB^(man)参与LM的胞内增殖和宿主脏器定植。本研究为了解LM PTS系统所介导的细菌体外环境适应及宿主感染的分子机制,以及LM感染的防控奠定了基础。
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关键词
单增李斯特菌
磷酸转移酶系统
IIB^(man)转运蛋白
运动性
感染
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职称材料
大肠杆菌P88噬菌体gp52和gp53基因对其裂解活性和宿主谱形成影响的研究
被引量：
1
2
作者
费定润
吴柔霖
+6 位作者
程丽丽
鲁珂蓥
庄楠茜
孙静
程昌勇
陈绵绵
宋厚辉
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第10期994-1000,共7页
为探究大肠杆菌溶原性噬菌体P88中非结构与功能基因gp52和gp53对其裂解活性和宿主谱形成的影响,本研究在P88宿主细菌K88基因组中对其进行基因工程操作,然后诱导出相应噬菌体进行功能研究。首先在大肠杆菌Red同源重组质粒p KD46基础上,融...
为探究大肠杆菌溶原性噬菌体P88中非结构与功能基因gp52和gp53对其裂解活性和宿主谱形成的影响,本研究在P88宿主细菌K88基因组中对其进行基因工程操作,然后诱导出相应噬菌体进行功能研究。首先在大肠杆菌Red同源重组质粒p KD46基础上,融合p ST98-AS质粒的四环素抗性基因和I-Sce I核酸内切酶基因,构建缺失质粒p WRG99。利用质粒p WRG99分别构建大肠杆菌K88的gp52和gp53基因缺失突变株(Δgp52和Δgp53)并经PCR和测序鉴定。利用丝裂霉素C诱导Δgp52和Δgp53,采用双层平板法检测噬菌体的裂解活性,结果显示,Δgp52和Δgp53的诱导液可以在大肠杆菌DE048为宿主菌的平皿上形成清晰的噬菌斑,表明Δgp52和Δgp53能诱导出可以感染DE048的噬菌体(将该噬菌体命名为P88-52和P88-53),并且gp52和gp53基因缺失均不影响噬菌体P88的形成和裂解活性。将P88-52和P88-53纯化并经电镜观察,结果显示,P88-52和P88-53与野生株P88形态相似,具有P2-like噬菌体典型的肌尾和短尾丝特征,表明gp52和gp53基因缺失均不影响P88噬菌体颗粒的形态。利用P88的宿主菌对P88-52和P88-53进行宿主谱分析,结果显示,P88-52和P88-53在DE048为宿主菌的平皿上均可以形成清晰的噬菌斑,在MC1061、DH5α和BL21为宿主菌的平皿上均不能形成噬菌斑,与噬菌体P88宿主谱相同,表明gp52和gp53基因缺失均不影响P88噬菌体的宿主谱。综上所述,在宿主菌K88基因组的基础上缺失gp52和gp53基因后,诱导出的P88突变噬菌体的裂解活性和宿主谱均不受影响。本研究通过在宿主菌中对前噬菌体基因编辑来研究溶原性噬菌体的基因功能,为其他溶原性噬菌体基因功能的研究提供了参考依据。
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关键词
大肠杆菌
前噬菌体
裂解活性
宿主谱
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职称材料
题名
单增李斯特菌PTS系统转运蛋白IIB^(man)介导运动性和感染的功能研究
被引量：
2
1
作者
张佳雪
陈绵绵
程丽丽
任耿佳
徐像文
鲁珂蓥
庄楠茜
孙静
宋厚辉
程昌勇
机构
浙江农林大学动物科技学院动物医学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室
台州市椒江区农业农村和水利局
出处
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第11期1179-1187,共9页
基金
浙江省自然科学基金(LQ20C180001、LY23C180002)
国家自然科学基金(32002253、31972648、31872620)
+1 种基金
浙江农林大学创新训练项目(S202210341103)
浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划(2023R412020)。
文摘
为探究单增李斯特菌(LM)磷酸转移酶系统(PTS)转运蛋白IIB^(man)在LM生长、运动性及其生物学功能,本研究以LM EGD-e株基因组为模板,经PCR扩增iiB^(man)基因的上下游基因片段(不包含iiB^(man)基因),插入质粒pKSV7以构建缺失质粒;以LM EGD-e基因组为模板,采用PCR扩增iiB^(man)基因与启动子片段,插入质粒pIMK2以构建回补质粒,经PCR和测序鉴定后,将缺失质粒转化LM EGD-e感受态细胞,通过氯霉素抗性及42℃压力下使重组质粒与LM EGD-e株的同源片段发生同源重组单交换获得一代同源重组菌株,然后在无抗性培养基中30℃培养使质粒丢失,获得缺失株ΔiiB^(man)。将回补质粒转化ΔiiB^(man)感受态细胞中,通过卡那霉素抗性筛选获得回补株CΔiiB^(man),缺失株和回补株均经PCR和测序鉴定。37℃培养EGD-e、ΔiiB^(man)、CΔiiB^(man)12 h,期间每隔1 h测定OD_(600nm)并绘制生长曲线,分析各菌株生长特性,结果显示,各菌株体外生长趋势相似。将各菌株菌液接种于TSA半固体培养基,培养至24 h和48 h时检测细菌运动圈大小,结果显示ΔiiB^(man)的运动圈直径分别是EGD-e的1.5及1.6倍(P<0.05、P<0.01),CΔiiB^(man)与EGD-e运动圈直径均基本一致。在各菌株培养上清中加入绵羊血,检测各菌株溶血能力,结果显示,ΔiiB^(man)的溶血能力较EGD-e及CΔiiB^(man)增强。将各菌株以MOI 20感染RAW264.7细胞,在感染后2 h、5 h和8 h收集细胞进行点样计数,结果显示,在感染后2 h和5 h时ΔiiB^(man)的胞内增殖能力较EGD-e及CΔiiB^(man)显著增强(P<0.05)。将各菌株以2×10^(5)cfu/只经腹腔注射感染小鼠48 h后剖杀,取肝脏和脾脏研磨并点样计数,结果显示,ΔiiB^(man)在小鼠脏器载菌量较EGD-e及CΔiiB^(man)极显著增多(P<0.001)。上述结果首次表明IIB^(man)不影响LM的生长,但影响LM的运动性及提高LM的体外溶血活性;IIB^(man)参与LM的胞内增殖和宿主脏器定植。本研究为了解LM PTS系统所介导的细菌体外环境适应及宿主感染的分子机制,以及LM感染的防控奠定了基础。
关键词
单增李斯特菌
磷酸转移酶系统
IIB^(man)转运蛋白
运动性
感染
Keywords
Listeria monocytogenes
phosphotransferase system(PTS)
iiB^(man) transporter protein
motility
infection
分类号
S852.61 [农业科学—基础兽医学]
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职称材料
题名
大肠杆菌P88噬菌体gp52和gp53基因对其裂解活性和宿主谱形成影响的研究
被引量：
1
2
作者
费定润
吴柔霖
程丽丽
鲁珂蓥
庄楠茜
孙静
程昌勇
陈绵绵
宋厚辉
机构
浙江农林大学动物科技学院/动物医学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室
台州市椒江区农业农村和水利局
出处
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第10期994-1000,共7页
基金
浙江省自然科学基金(LQ20C180001、LY23C180002)
国家自然科学基金(32002253、31972648、31872620)
+1 种基金
浙江农林大学创新训练项目(S202210341103)
浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划(2023R412020)。
文摘
为探究大肠杆菌溶原性噬菌体P88中非结构与功能基因gp52和gp53对其裂解活性和宿主谱形成的影响,本研究在P88宿主细菌K88基因组中对其进行基因工程操作,然后诱导出相应噬菌体进行功能研究。首先在大肠杆菌Red同源重组质粒p KD46基础上,融合p ST98-AS质粒的四环素抗性基因和I-Sce I核酸内切酶基因,构建缺失质粒p WRG99。利用质粒p WRG99分别构建大肠杆菌K88的gp52和gp53基因缺失突变株(Δgp52和Δgp53)并经PCR和测序鉴定。利用丝裂霉素C诱导Δgp52和Δgp53,采用双层平板法检测噬菌体的裂解活性,结果显示,Δgp52和Δgp53的诱导液可以在大肠杆菌DE048为宿主菌的平皿上形成清晰的噬菌斑,表明Δgp52和Δgp53能诱导出可以感染DE048的噬菌体(将该噬菌体命名为P88-52和P88-53),并且gp52和gp53基因缺失均不影响噬菌体P88的形成和裂解活性。将P88-52和P88-53纯化并经电镜观察,结果显示,P88-52和P88-53与野生株P88形态相似,具有P2-like噬菌体典型的肌尾和短尾丝特征,表明gp52和gp53基因缺失均不影响P88噬菌体颗粒的形态。利用P88的宿主菌对P88-52和P88-53进行宿主谱分析,结果显示,P88-52和P88-53在DE048为宿主菌的平皿上均可以形成清晰的噬菌斑,在MC1061、DH5α和BL21为宿主菌的平皿上均不能形成噬菌斑,与噬菌体P88宿主谱相同,表明gp52和gp53基因缺失均不影响P88噬菌体的宿主谱。综上所述,在宿主菌K88基因组的基础上缺失gp52和gp53基因后,诱导出的P88突变噬菌体的裂解活性和宿主谱均不受影响。本研究通过在宿主菌中对前噬菌体基因编辑来研究溶原性噬菌体的基因功能,为其他溶原性噬菌体基因功能的研究提供了参考依据。
关键词
大肠杆菌
前噬菌体
裂解活性
宿主谱
Keywords
Escherichia coli
prophage
lytic activity
host range
分类号
S852.61 [农业科学—基础兽医学]
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1
单增李斯特菌PTS系统转运蛋白IIB^(man)介导运动性和感染的功能研究
张佳雪
陈绵绵
程丽丽
任耿佳
徐像文
鲁珂蓥
庄楠茜
孙静
宋厚辉
程昌勇
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2023
2
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职称材料
2
大肠杆菌P88噬菌体gp52和gp53基因对其裂解活性和宿主谱形成影响的研究
费定润
吴柔霖
程丽丽
鲁珂蓥
庄楠茜
孙静
程昌勇
陈绵绵
宋厚辉
《中国预防兽医学报》
CAS
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