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题名重组葡萄糖脱氢酶的表达及辅酶再生应用研究
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作者
李凌凌
刘曜宁
吕早生
杨忠华
左振宇
宋采薇
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机构
武汉科技大学化学与化工学院
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出处
《武汉科技大学学报》
CAS
北大核心
2017年第2期155-160,共6页
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基金
国家自然科学基金资助项目(21376184)
武汉科技大学青年科技骨干培育计划项目(2016XZ014)
武汉科技大学大学生科技创新基金研究项目(16ZRA044)
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文摘
为解决异源表达酮还原酶域EryKR1的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(pET28a-eryKR1)催化环己酮还原时消耗的氢供体NADPH再生的问题,构建了克隆枯草芽孢杆菌葡萄糖脱氢酶基因gdh的重组菌E.coli BL21(pET28a-gdh),其中的gdh基因经Nucleotide BLAST功能分析显示与枯草芽孢杆菌9902的gdh基因序列(登录号为EF626962.1)的一致性达到100%。SDS-PAGE检测显示该重组菌经IPTG诱导后可以高效表达出葡萄糖脱氢酶(GDH),其表达量占全菌可溶性蛋白质的64%。GDH粗酶液的比酶活为137.90U/mg。通过气相色谱检测添加了E.coli BL21(pET28a-gdh)的E.coli BL21(pET28a-eryKR1)环己酮还原反应体系中的环己醇含量,结果显示加入重组GDH的双重组菌耦合反应体系中环己醇的产率为82.21%,是未添加GDH的反应体系对应值的3.23倍,表明重组GDH可以为EryKR1还原环己酮系统解决辅酶再生问题。
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关键词
葡萄糖脱氢酶
重组菌
异源表达
辅酶再生
生物催化
环己酮
枯草芽孢杆菌
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Keywords
glucose dehydrogenase
recombinant strain
heterologous expression
coenzyme regeneration
biocatalysis
cyclohexanone
Bacillus subtilis
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分类号
Q789
[生物学—分子生物学]
TQ925
[轻工技术与工程—发酵工程]
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题名酮还原酶中立体选择性还原位点的突变及其产物分析
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作者
李凌凌
吕早生
左振宇
杨忠华
刘曜宁
宋采薇
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机构
武汉科技大学化学与化工学院
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出处
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2017年第6期214-222,共9页
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基金
国家自然科学基金资助项目(21376184)
湖北省科技厅基金项目(2009CDA006)
+1 种基金
武汉科技大学青年科技骨干培育计划项目(2016XZ014)
武汉科技大学大学生科技创新基金研究项目(16ZRA044)
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文摘
为验证糖多孢红霉菌聚酮合成酶中酮还原酶(Ery KR)的LDD模式序列是否为控制2-甲基环己酮立体选择性还原的位点,构建了分别异源表达聚酮合成酶模块1的酮还原酶(Ery KR1)、模块2的酮还原酶(Ery KR2)、LDD残基替换为PQQ(LDD→PQQ)的EryKR1及PQQ替换为LDD(PQQ→LDD)的Ery KR2的重组大肠杆菌Escherichia coli BL21(p ET28a-eryKR1)、E.coliBL21(pET28a-ery KR2)、E.coli BL21(p ET28a-Tery KR1)和E.coli BL21(p ET28a-Tery KR2)。SDS-PAGE实验证明,经IPTG诱导后4个重组菌中都表达出相应的酮还原酶。粗酶液的比酶活分别为1.49 U/mg、0.37 U/mg、0.94 U/mg和0.31 U/mg。利用气相色谱分别检测4个重组菌还原2-甲基环己酮体系中产物的立体结构,结果显示与野生型Ery KR1的还原产物以顺式-2-甲基环己醇为主不同,LDD→PQQ的突变型Ery KR1催化2-甲基环己酮的还原产物主要为反式-2-甲基环己醇,而PQQ→LDD的突变型Ery KR2的主要还原产物也由野生型Ery KR2的反式-2-甲基环己醇转变成顺式-2-甲基环己醇,证实了LDD模式序列确实为酶中控制2-甲基环己酮立体选择性还原的位点。
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关键词
聚酮合成酶
酮还原酶
2-甲基环己酮
突变
立体选择性
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Keywords
polyketide synthase
ketoreductase
2-methylcyclohexanone
mutation
stereoselectivity
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分类号
O629.8
[理学—有机化学]
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