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肝素黄杆菌硫酸软骨素酶AC的高效重组表达体系构建及其酶学性质研究
被引量：
4
1
作者
吴敬君
李晔
+2 位作者
张翀
李梅
邢新会
《食品科学》
EI
CAS
CSCD
北大核心
2013年第9期127-134,共8页
为实现硫酸软骨素酶AC(chondroitinase AC,ChonAC)在大肠杆菌中高效表达,通过PCR方法从肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus)中扩增得到ChonAC基因cslA,采用融合蛋白技术构建麦芽糖结合蛋白(maltose-bindingprotein,MBP)与ChonAC的融合表...
为实现硫酸软骨素酶AC(chondroitinase AC,ChonAC)在大肠杆菌中高效表达,通过PCR方法从肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus)中扩增得到ChonAC基因cslA,采用融合蛋白技术构建麦芽糖结合蛋白(maltose-bindingprotein,MBP)与ChonAC的融合表达载体(MBP-ChonAC),并在低温(15℃)条件下实现MBP-ChonAC的可溶活性表达,通过MBPTrap HP可实现一步纯化,使纯度可达95%以上,酶比活力可达94.1IU/mg融合蛋白(即相当于143.8IU/mgChonAC蛋白当量)。对MBP-ChonAC的酶学研究发现,其最佳催化pH值为7.5～8.0,最佳Ca2+浓度为20mmol/L,最适NaCl浓度为50mmol/L,最佳作用温度为20～35℃。MBP-ChonAC具有较好的热稳定性,在30℃时其半衰期可达8.3h。同时对其以硫酸软骨素A为底物的动力学常数测定发现,MBP-ChonAC相比ChonAC其Km稍有增大而催化常数kcat稍有降低,但是差别不大,表明MBP的融合没有对ChonAC的催化能力造成影响。通过宿主优化、诱导浓度优化及培养基优化进一步提高了MBP-ChonAC的表达量,其摇瓶培养酶活力就可达10800.5IU/L。
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关键词
亲和纯化
硫酸软骨素酶AC
酶学性质
表达量优化
麦芽糖结合蛋白
重组表达
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职称材料
MBP融合肝素酶Ⅲ大肠杆菌高效表达体系构建
被引量：
4
2
作者
苏楠
吴敬君
+3 位作者
李晔
张翀
李梅
邢新会
《化工学报》
EI
CAS
CSCD
北大核心
2014年第7期2829-2842,共14页
肝素酶Ⅲ(heparinase III,HepC)是一种重要的多糖裂解酶,在抗癌药物开发、低分子量肝素生产以及肝素类药物的质量控制等方面具有重要的作用。目前制约其工业应用前景的主要技术瓶颈是生产成本高,异源重组表达效果差,缺乏高效的表达方法...
肝素酶Ⅲ(heparinase III,HepC)是一种重要的多糖裂解酶,在抗癌药物开发、低分子量肝素生产以及肝素类药物的质量控制等方面具有重要的作用。目前制约其工业应用前景的主要技术瓶颈是生产成本高,异源重组表达效果差,缺乏高效的表达方法。本研究借鉴前期经验,通过HepC基因的密码子优化,并与麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)融合,构建了MBP-coHepC(基因密码子优化后的蛋白为coHepC)的大肠杆菌表达体系,结合培养条件优化大幅度提高了HepC的可溶表达比例,其摇瓶发酵总酶活值达到7603.46 IU·L?1;同时,本研究从转录和翻译水平揭示了HepC表达效果提高的可能原因。这些研究为肝素酶III的应用发展提供了基础。
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关键词
麦芽糖结合蛋白
肝素酶Ⅲ
融合蛋白
序列优化
大肠杆菌
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职称材料
肝素黄杆菌肝素酶Ⅲ基因hepC的可溶表达体系构建及酶学性质研究
被引量：
2
3
作者
李晔
吴敬君
+3 位作者
叶逢春
苏楠
张翀
邢新会
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2013年第6期133-139,共7页
肝素酶III(HepC)是肝素结构分析及酶法制备低分子量肝素的重要生物催化剂。为实现HepC在大肠杆菌中的可溶表达,通过PCR方法从肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)的基因组中扩增得到HepC基因,采用融合蛋白方法构建了麦芽糖结合蛋白(M...
肝素酶III(HepC)是肝素结构分析及酶法制备低分子量肝素的重要生物催化剂。为实现HepC在大肠杆菌中的可溶表达,通过PCR方法从肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)的基因组中扩增得到HepC基因,采用融合蛋白方法构建了麦芽糖结合蛋白(MBP)与HepC融合的表达载体和体系,并在低温(15℃)下诱导重组大肠杆菌,显著提高了MBP-HepC重组表达的可溶性。通过摇瓶培养发酵液的HepC比酶活达到46.41 IU/mg,超过目前报道的最高水平。通过MBP与直链淀粉的亲和吸附实现了MBP-HepC的亲和分离和纯化,一步亲和纯化后蛋白的纯度即可达95%以上。该融合酶基本特性研究表明,融合肝素酶III(MBP-HepC)的最适作用pH7.3,最适作用温度为42℃-48℃。热稳定性较好,其30℃时的稳定性高于融合肝素酶I(MBP-HepA)。
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关键词
肝素酶III
麦芽糖结合蛋白
重组表达
纯化
酶学性质
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职称材料
题名
肝素黄杆菌硫酸软骨素酶AC的高效重组表达体系构建及其酶学性质研究
被引量：
4
1
作者
吴敬君
李晔
张翀
李梅
邢新会
机构
清华大学化学工程系工业生物催化教育部重点实验室
北京电子科技职业学院生物技术系
出处
《食品科学》
EI
CAS
CSCD
北大核心
2013年第9期127-134,共8页
基金
国家“863”计划项目(2012AA022201)
北京市属高等学校人才强教计划项目(PHR201107151)
+1 种基金
北京电子科技职业学院院内重点课题(YZKB2011003)
北京市属高等学校人才强教深化计划资助项目
文摘
为实现硫酸软骨素酶AC(chondroitinase AC,ChonAC)在大肠杆菌中高效表达,通过PCR方法从肝素黄杆菌(Pedobacter heparinus)中扩增得到ChonAC基因cslA,采用融合蛋白技术构建麦芽糖结合蛋白(maltose-bindingprotein,MBP)与ChonAC的融合表达载体(MBP-ChonAC),并在低温(15℃)条件下实现MBP-ChonAC的可溶活性表达,通过MBPTrap HP可实现一步纯化,使纯度可达95%以上,酶比活力可达94.1IU/mg融合蛋白(即相当于143.8IU/mgChonAC蛋白当量)。对MBP-ChonAC的酶学研究发现,其最佳催化pH值为7.5～8.0,最佳Ca2+浓度为20mmol/L,最适NaCl浓度为50mmol/L,最佳作用温度为20～35℃。MBP-ChonAC具有较好的热稳定性,在30℃时其半衰期可达8.3h。同时对其以硫酸软骨素A为底物的动力学常数测定发现,MBP-ChonAC相比ChonAC其Km稍有增大而催化常数kcat稍有降低,但是差别不大,表明MBP的融合没有对ChonAC的催化能力造成影响。通过宿主优化、诱导浓度优化及培养基优化进一步提高了MBP-ChonAC的表达量,其摇瓶培养酶活力就可达10800.5IU/L。
关键词
亲和纯化
硫酸软骨素酶AC
酶学性质
表达量优化
麦芽糖结合蛋白
重组表达
Keywords
affinity purification
chondroitinase AC（ChonAC）
enzymatic characteristics
expression level optimization
maltose-binding protein（MBP）
recombinant expression
分类号
Q814.1 [生物学—生物工程]
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职称材料
题名
MBP融合肝素酶Ⅲ大肠杆菌高效表达体系构建
被引量：
4
2
作者
苏楠
吴敬君
李晔
张翀
李梅
邢新会
机构
清华大学化学工程系
北京电子科技职业技术学院生物技术系
出处
《化工学报》
EI
CAS
CSCD
北大核心
2014年第7期2829-2842,共14页
基金
国家高技术研究发展计划项目(2012AA022201E)
博士后基金面上资助项目(2012M510460)~~
文摘
肝素酶Ⅲ(heparinase III,HepC)是一种重要的多糖裂解酶,在抗癌药物开发、低分子量肝素生产以及肝素类药物的质量控制等方面具有重要的作用。目前制约其工业应用前景的主要技术瓶颈是生产成本高,异源重组表达效果差,缺乏高效的表达方法。本研究借鉴前期经验,通过HepC基因的密码子优化,并与麦芽糖结合蛋白(maltose-binding protein,MBP)融合,构建了MBP-coHepC(基因密码子优化后的蛋白为coHepC)的大肠杆菌表达体系,结合培养条件优化大幅度提高了HepC的可溶表达比例,其摇瓶发酵总酶活值达到7603.46 IU·L?1;同时,本研究从转录和翻译水平揭示了HepC表达效果提高的可能原因。这些研究为肝素酶III的应用发展提供了基础。
关键词
麦芽糖结合蛋白
肝素酶Ⅲ
融合蛋白
序列优化
大肠杆菌
Keywords
MBP
heparinaseⅢ
fusion protein： codonoptimization
Escherichiacoli
分类号
TQ028.8 [化学工程]
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职称材料
题名
肝素黄杆菌肝素酶Ⅲ基因hepC的可溶表达体系构建及酶学性质研究
被引量：
2
3
作者
李晔
吴敬君
叶逢春
苏楠
张翀
邢新会
机构
北京电子科技职业学院
清华大学化学工程系生物化工研究所
出处
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2013年第6期133-139,共7页
基金
国家自然科学基金重点项目(20836004)
中国博士后科学基金项目(20100470140)
北京电子科技职业学院院内重点课题(YZKB20-11003)
文摘
肝素酶III(HepC)是肝素结构分析及酶法制备低分子量肝素的重要生物催化剂。为实现HepC在大肠杆菌中的可溶表达,通过PCR方法从肝素黄杆菌(Flavobacterium heparinum)的基因组中扩增得到HepC基因,采用融合蛋白方法构建了麦芽糖结合蛋白(MBP)与HepC融合的表达载体和体系,并在低温(15℃)下诱导重组大肠杆菌,显著提高了MBP-HepC重组表达的可溶性。通过摇瓶培养发酵液的HepC比酶活达到46.41 IU/mg,超过目前报道的最高水平。通过MBP与直链淀粉的亲和吸附实现了MBP-HepC的亲和分离和纯化,一步亲和纯化后蛋白的纯度即可达95%以上。该融合酶基本特性研究表明,融合肝素酶III(MBP-HepC)的最适作用pH7.3,最适作用温度为42℃-48℃。热稳定性较好,其30℃时的稳定性高于融合肝素酶I(MBP-HepA)。
关键词
肝素酶III
麦芽糖结合蛋白
重组表达
纯化
酶学性质
Keywords
Heparinase III Maltose binding protein（MBP） Recombinate expression Purification Characterization
分类号
Q78 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
肝素黄杆菌硫酸软骨素酶AC的高效重组表达体系构建及其酶学性质研究
吴敬君
李晔
张翀
李梅
邢新会
《食品科学》
EI
CAS
CSCD
北大核心
2013
4
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
MBP融合肝素酶Ⅲ大肠杆菌高效表达体系构建
苏楠
吴敬君
李晔
张翀
李梅
邢新会
《化工学报》
EI
CAS
CSCD
北大核心
2014
4
在线阅读
下载PDF
职称材料
3
肝素黄杆菌肝素酶Ⅲ基因hepC的可溶表达体系构建及酶学性质研究
李晔
吴敬君
叶逢春
苏楠
张翀
邢新会
《生物技术通报》
CAS
CSCD
北大核心
2013
2
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职称材料
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