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CD47重组质粒及其过表达重组大鼠骨髓间充质干细胞的构建及鉴定
被引量：
1
1
作者
叶力文
邓玮
+2 位作者
陈庆伟
柯大智
李桂琼
《中国免疫学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2014年第9期1213-1217,1223,共6页
目的:构建CD47重组质粒并将其转染至大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs),建立稳定过表达CD47的BMMSCs,为研究干细胞治疗中逃避免疫监视的有关机制提供实验模型。方法:构建过表达CD47基因的质粒载体,转染...
目的:构建CD47重组质粒并将其转染至大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs),建立稳定过表达CD47的BMMSCs,为研究干细胞治疗中逃避免疫监视的有关机制提供实验模型。方法:构建过表达CD47基因的质粒载体,转染至分离培养的大鼠BMMSCs,RT-PCR、Western blot分别检测干细胞CD47 mRNA、蛋白水平的表达,并完成功能检测。结果:成功构建了pYr-ads-4-ratCD47质粒,经酶切、测序结果表明pYr-ads-4-ratCD47重组质粒构建成功;RT-PCR、Western blot显示实验组转染至大鼠BMMSCs后CD47的mRNA和蛋白水平表达明显增高(P<0.05);功能检测提示过表达CD47分子的BMMSCs成功逃避巨噬细胞吞噬。结论:经质粒介导可成功将大鼠CD47目的基因片段转染至大鼠BMMSCs,并能够在体外有效的过表达。
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关键词
CD47
骨髓间充质干细胞
重组质粒
转染
表达
在线阅读
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职称材料
microRNA-145通过靶向抑制CREB调节内皮细胞增殖和血管新生
被引量：
2
2
作者
阳喜喜
陈庆伟
+1 位作者
叶力文
王健
《第三军医大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2018年第13期1213-1220,共8页
目的构建微小RNA 145(microRNA-145,miR-145)过表达及干扰腺病毒载体,并探究miR-145对内皮细胞增殖和血管新生的影响及机制。方法利用T4连接酶分别将miR-145过表达和干扰目的序列插入到pHBAd-EF1-MCS-GFP和pHBAd-U6-CMV-GFP载体,构建出...
目的构建微小RNA 145(microRNA-145,miR-145)过表达及干扰腺病毒载体,并探究miR-145对内皮细胞增殖和血管新生的影响及机制。方法利用T4连接酶分别将miR-145过表达和干扰目的序列插入到pHBAd-EF1-MCS-GFP和pHBAd-U6-CMV-GFP载体,构建出重组miR-145过表达和干扰腺病毒质粒。将重组miR-145过表达和干扰腺病毒质粒分别与骨架质粒pHBAd-BHG共转染人胚肾HEK293细胞进行重组腺病毒的包装与扩增,TCID_(50)法检测病毒感染滴度。miRNA qRT-PCR检测感染腺病毒的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中miR-145的表达水平,MTT及Western blot检测PCNA蛋白表达量以检测细胞增殖情况。小管形成实验检测血管生成能力的变化。采用miRanda、miRwalk等生物信息学方法预测miR-145的靶基因及与环磷腺苷反应元件结合蛋白(cAMP response element-binding protein,CREB)3'UTR的结合位点。Western blot检测CREB及其调控的VEGF的表达情况,双荧光素酶实验验证miR-145与目的基因CREB 3'UTR相互作用。结果基因测序提示miR-145过表达及干扰质粒序列与目标序列一致,qRT-PCR结果亦提示病毒构建成功。细胞增殖和小管形成实验结果显示,与转染空载体组相比,过表达miR-145使570 nm处光密度值明显降低(P<0.05),亦显著抑制了HUVECs PCNA蛋白表达和小管样结构的形成(P<0.01),而干扰miR-145表达则使光密度值增高(P<0.01),亦促进HUVECs PCNA蛋白表达和小管样结构的形成(P<0.05)。同时,过表达miR-145可显著抑制CREB和VEGF蛋白表达(P<0.05),而干扰miR-145表达则明显促进CREB和VEGF蛋白上调(P<0.05)。双荧光素酶实验亦证实了miR-145与CREB 3'UTR的直接结合作用。结论 miR-145调节内皮细胞增殖和血管新生,其机制与miR-145直接靶向抑制CREB/VEGF信号有关。
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关键词
MIR-145
内皮细胞
血管新生
CREB
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职称材料
题名
CD47重组质粒及其过表达重组大鼠骨髓间充质干细胞的构建及鉴定
被引量：
1
1
作者
叶力文
邓玮
陈庆伟
柯大智
李桂琼
机构
重庆医科大学附属第二医院老年心血管病科
出处
《中国免疫学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2014年第9期1213-1217,1223,共6页
基金
国家自然科学基金青年项目(No.81201101)
重庆市卫生局科学研究计划项目资助(No.2012-2-057)
文摘
目的:构建CD47重组质粒并将其转染至大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMMSCs),建立稳定过表达CD47的BMMSCs,为研究干细胞治疗中逃避免疫监视的有关机制提供实验模型。方法:构建过表达CD47基因的质粒载体,转染至分离培养的大鼠BMMSCs,RT-PCR、Western blot分别检测干细胞CD47 mRNA、蛋白水平的表达,并完成功能检测。结果:成功构建了pYr-ads-4-ratCD47质粒,经酶切、测序结果表明pYr-ads-4-ratCD47重组质粒构建成功;RT-PCR、Western blot显示实验组转染至大鼠BMMSCs后CD47的mRNA和蛋白水平表达明显增高(P<0.05);功能检测提示过表达CD47分子的BMMSCs成功逃避巨噬细胞吞噬。结论:经质粒介导可成功将大鼠CD47目的基因片段转染至大鼠BMMSCs,并能够在体外有效的过表达。
关键词
CD47
骨髓间充质干细胞
重组质粒
转染
表达
Keywords
CD47 gene
Bone marrow mesenchymal stem cells
Recombinant plasmid
Expression
Transfection
分类号
R392 [医药卫生—免疫学]
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职称材料
题名
microRNA-145通过靶向抑制CREB调节内皮细胞增殖和血管新生
被引量：
2
2
作者
阳喜喜
陈庆伟
叶力文
王健
机构
重庆医科大学附属第二医院老年心血管病科
出处
《第三军医大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2018年第13期1213-1220,共8页
文摘
目的构建微小RNA 145(microRNA-145,miR-145)过表达及干扰腺病毒载体,并探究miR-145对内皮细胞增殖和血管新生的影响及机制。方法利用T4连接酶分别将miR-145过表达和干扰目的序列插入到pHBAd-EF1-MCS-GFP和pHBAd-U6-CMV-GFP载体,构建出重组miR-145过表达和干扰腺病毒质粒。将重组miR-145过表达和干扰腺病毒质粒分别与骨架质粒pHBAd-BHG共转染人胚肾HEK293细胞进行重组腺病毒的包装与扩增,TCID_(50)法检测病毒感染滴度。miRNA qRT-PCR检测感染腺病毒的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)中miR-145的表达水平,MTT及Western blot检测PCNA蛋白表达量以检测细胞增殖情况。小管形成实验检测血管生成能力的变化。采用miRanda、miRwalk等生物信息学方法预测miR-145的靶基因及与环磷腺苷反应元件结合蛋白(cAMP response element-binding protein,CREB)3'UTR的结合位点。Western blot检测CREB及其调控的VEGF的表达情况,双荧光素酶实验验证miR-145与目的基因CREB 3'UTR相互作用。结果基因测序提示miR-145过表达及干扰质粒序列与目标序列一致,qRT-PCR结果亦提示病毒构建成功。细胞增殖和小管形成实验结果显示,与转染空载体组相比,过表达miR-145使570 nm处光密度值明显降低(P<0.05),亦显著抑制了HUVECs PCNA蛋白表达和小管样结构的形成(P<0.01),而干扰miR-145表达则使光密度值增高(P<0.01),亦促进HUVECs PCNA蛋白表达和小管样结构的形成(P<0.05)。同时,过表达miR-145可显著抑制CREB和VEGF蛋白表达(P<0.05),而干扰miR-145表达则明显促进CREB和VEGF蛋白上调(P<0.05)。双荧光素酶实验亦证实了miR-145与CREB 3'UTR的直接结合作用。结论 miR-145调节内皮细胞增殖和血管新生,其机制与miR-145直接靶向抑制CREB/VEGF信号有关。
关键词
MIR-145
内皮细胞
血管新生
CREB
Keywords
miRNA-145
endothelial cells
angiogenesis
cAMP-responsive element-binding protein
分类号
R322.12 [医药卫生—人体解剖和组织胚胎学]
R329.28 [医药卫生—人体解剖和组织胚胎学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
CD47重组质粒及其过表达重组大鼠骨髓间充质干细胞的构建及鉴定
叶力文
邓玮
陈庆伟
柯大智
李桂琼
《中国免疫学杂志》
CAS
CSCD
北大核心
2014
1
在线阅读
下载PDF
职称材料
2
microRNA-145通过靶向抑制CREB调节内皮细胞增殖和血管新生
阳喜喜
陈庆伟
叶力文
王健
《第三军医大学学报》
CAS
CSCD
北大核心
2018
2
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