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标签谷胱甘肽S-转移酶的二价亲和标记试剂的制备与应用
1
作者
卢进鹏
夏超
+4 位作者
周伟
李亚平
胡小蕾
廖飞
杨晓兰
《应用化学》
CAS
CSCD
北大核心
2019年第4期402-413,共12页
设计合成融合表达标签谷胱甘肽S-转移酶(GST)的二价亲和标记试剂,用于功能化磁珠后位点选择性固定化标签GST,为磁分离筛选配体混合物库提供固定化融合靶蛋白的候选方案。为减少疏水配体在标签GST活性位点的结合,需同时占据标签GST双活...
设计合成融合表达标签谷胱甘肽S-转移酶(GST)的二价亲和标记试剂,用于功能化磁珠后位点选择性固定化标签GST,为磁分离筛选配体混合物库提供固定化融合靶蛋白的候选方案。为减少疏水配体在标签GST活性位点的结合,需同时占据标签GST双活性中心内疏水结合位点并发生共价修饰的二价亲和标记试剂。以双苯环为疏水定位基、溴乙酰基为巯基修饰基团、羧基为连接官能团得单价标记试剂,以二乙基三胺为连接臂将单价标记试剂与连接臂两端伯胺连接得标签GST的对称二价亲和标记试剂,再以线性三胺连接臂中间的氨基与羧基磁珠偶联得功能化磁珠。表征目标化合物对标签GST的标记动力学、结合比;功能化磁珠对标签GST的不可逆固定化动力学和固载容量,及将磁珠表面二价亲和标记试剂转变成还原型谷胱甘肽(GSH)加合物后对标签GST可逆固定化的效果;以碱性磷酸酶及疏水荧光配体为模型考察磁珠固定化标签GST后的非特异结合。目标化合物对标签GST半抑制浓度为(22±0. 2)μmol/L,其与GSH的饱和加合物半抑制浓度为(0. 41±0. 06)μmol/L,二者与标签GST二聚体结合比接近1∶1。功能化磁珠对标签GST不可逆及可逆固定化的容量均接近25 mg/g磁珠。偶联GST的磁珠对蛋白非特异吸附很弱,再进一步用单价亲和标记试剂和GSH加合物封闭固定化标签GST剩余的活性位点后对疏水小分子也无显著结合。结果表明,所设计二价亲和标记试剂功能化磁珠适合用于标签GST及其融合表达蛋白的位点选择性固定化。
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关键词
谷胱甘肽S-转移酶
亲和标记试剂
磁珠
固定化
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职称材料
芳香硫酸酯酶定点饱和突变方案的比较
2
作者
李亚平
种慧敏
+5 位作者
袁梅
周伟
卢进鹏
胡小蕾
廖飞
杨晓兰
《西安交通大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2019年第3期459-464,共6页
目的比较随机引物与精确引物PCR扩增实施绿脓杆菌芳香硫酸酯酶(Pseudomonas aeruginosa arylsulfatase, PAAS)定点饱和突变的整体效率及成本,以建立高效实用的定点饱和突变方案。方法以大肠杆菌碱性磷酸酶(Escherichia coli alkaline ph...
目的比较随机引物与精确引物PCR扩增实施绿脓杆菌芳香硫酸酯酶(Pseudomonas aeruginosa arylsulfatase, PAAS)定点饱和突变的整体效率及成本,以建立高效实用的定点饱和突变方案。方法以大肠杆菌碱性磷酸酶(Escherichia coli alkaline phosphatase, ECAP)与PAAS融合表达质粒为模板,分别用针对PAAS目的位点的随机引物、精确引物等量混合物及单个精确引物,进行全质粒PCR扩增构建定点饱和突变体库;碱裂解细胞后高通量测定PAAS突变体与ECAP活性比值进行筛选,比较3种定点饱和突变建库方案需筛选的单克隆数量、所获突变体种类、整体耗时、整体成本及影响因素。结果用随机引物PCR对M72位定点饱和突变有明显密码子偏好性,筛选超600个单克隆仅获得10种预期突变体,但对G138位定点饱和突变未见明显的密码子偏好性且筛选不到150个单克隆获得18种预期突变体;精确引物等量混合物对M72位实施定点饱和突变,筛选不超过190个克隆成功获得19种预期突变体;单个精确引物对M72位逐个PCR实施定点饱和突变,仅各筛选2个单克隆就获得19种预期突变体。单个精确引物逐个PCR实施定点突变所获饱和突变体库完整,需筛选的单克隆数最少,总耗时和总成本最低;相比之下,用随机引物和精确引物等量混合物实施定点饱和突变时,所需筛选的单克隆数、整体耗时及成本均显著增加。结论解析序列-活性关系时,用单个精确引物逐个PCR实施定点饱和突变有显著整体成本和效率优势;仅筛选阳性突变体时,用精确引物等量混合物进行PCR建库在成本和效率上更有优势。
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关键词
芳香硫酸酯酶
定点饱和突变
随机引物
精确引物等量混合物
单个精确引物
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职称材料
题名
标签谷胱甘肽S-转移酶的二价亲和标记试剂的制备与应用
1
作者
卢进鹏
夏超
周伟
李亚平
胡小蕾
廖飞
杨晓兰
机构
重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学教育部重点实验室
重庆理工大学药学与生物工程学院
出处
《应用化学》
CAS
CSCD
北大核心
2019年第4期402-413,共12页
基金
国家自然科学基金(31570862
81773625)资助项目~~
文摘
设计合成融合表达标签谷胱甘肽S-转移酶(GST)的二价亲和标记试剂,用于功能化磁珠后位点选择性固定化标签GST,为磁分离筛选配体混合物库提供固定化融合靶蛋白的候选方案。为减少疏水配体在标签GST活性位点的结合,需同时占据标签GST双活性中心内疏水结合位点并发生共价修饰的二价亲和标记试剂。以双苯环为疏水定位基、溴乙酰基为巯基修饰基团、羧基为连接官能团得单价标记试剂,以二乙基三胺为连接臂将单价标记试剂与连接臂两端伯胺连接得标签GST的对称二价亲和标记试剂,再以线性三胺连接臂中间的氨基与羧基磁珠偶联得功能化磁珠。表征目标化合物对标签GST的标记动力学、结合比;功能化磁珠对标签GST的不可逆固定化动力学和固载容量,及将磁珠表面二价亲和标记试剂转变成还原型谷胱甘肽(GSH)加合物后对标签GST可逆固定化的效果;以碱性磷酸酶及疏水荧光配体为模型考察磁珠固定化标签GST后的非特异结合。目标化合物对标签GST半抑制浓度为(22±0. 2)μmol/L,其与GSH的饱和加合物半抑制浓度为(0. 41±0. 06)μmol/L,二者与标签GST二聚体结合比接近1∶1。功能化磁珠对标签GST不可逆及可逆固定化的容量均接近25 mg/g磁珠。偶联GST的磁珠对蛋白非特异吸附很弱,再进一步用单价亲和标记试剂和GSH加合物封闭固定化标签GST剩余的活性位点后对疏水小分子也无显著结合。结果表明,所设计二价亲和标记试剂功能化磁珠适合用于标签GST及其融合表达蛋白的位点选择性固定化。
关键词
谷胱甘肽S-转移酶
亲和标记试剂
磁珠
固定化
Keywords
glutathione S-transferase
affinity labeling reagents
magnetic particles
immobilization
分类号
TQ421.12 [化学工程]
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职称材料
题名
芳香硫酸酯酶定点饱和突变方案的比较
2
作者
李亚平
种慧敏
袁梅
周伟
卢进鹏
胡小蕾
廖飞
杨晓兰
机构
重庆医科大学检验医学院临床检验诊断学教育部重点实验室
重庆理工大学药学与生物工程学院
出处
《西安交通大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2019年第3期459-464,共6页
基金
国家自然科学基金资助项目(No.31570862
No.81773625)~~
文摘
目的比较随机引物与精确引物PCR扩增实施绿脓杆菌芳香硫酸酯酶(Pseudomonas aeruginosa arylsulfatase, PAAS)定点饱和突变的整体效率及成本,以建立高效实用的定点饱和突变方案。方法以大肠杆菌碱性磷酸酶(Escherichia coli alkaline phosphatase, ECAP)与PAAS融合表达质粒为模板,分别用针对PAAS目的位点的随机引物、精确引物等量混合物及单个精确引物,进行全质粒PCR扩增构建定点饱和突变体库;碱裂解细胞后高通量测定PAAS突变体与ECAP活性比值进行筛选,比较3种定点饱和突变建库方案需筛选的单克隆数量、所获突变体种类、整体耗时、整体成本及影响因素。结果用随机引物PCR对M72位定点饱和突变有明显密码子偏好性,筛选超600个单克隆仅获得10种预期突变体,但对G138位定点饱和突变未见明显的密码子偏好性且筛选不到150个单克隆获得18种预期突变体;精确引物等量混合物对M72位实施定点饱和突变,筛选不超过190个克隆成功获得19种预期突变体;单个精确引物对M72位逐个PCR实施定点饱和突变,仅各筛选2个单克隆就获得19种预期突变体。单个精确引物逐个PCR实施定点突变所获饱和突变体库完整,需筛选的单克隆数最少,总耗时和总成本最低;相比之下,用随机引物和精确引物等量混合物实施定点饱和突变时,所需筛选的单克隆数、整体耗时及成本均显著增加。结论解析序列-活性关系时,用单个精确引物逐个PCR实施定点饱和突变有显著整体成本和效率优势;仅筛选阳性突变体时,用精确引物等量混合物进行PCR建库在成本和效率上更有优势。
关键词
芳香硫酸酯酶
定点饱和突变
随机引物
精确引物等量混合物
单个精确引物
Keywords
arylsulfatase
site-directed saturation mutagenesis
random primer
equal-mole mixture of precise primer
purified precise primer
分类号
Q754 [生物学—分子生物学]
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职称材料
题名
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1
标签谷胱甘肽S-转移酶的二价亲和标记试剂的制备与应用
卢进鹏
夏超
周伟
李亚平
胡小蕾
廖飞
杨晓兰
《应用化学》
CAS
CSCD
北大核心
2019
0
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职称材料
2
芳香硫酸酯酶定点饱和突变方案的比较
李亚平
种慧敏
袁梅
周伟
卢进鹏
胡小蕾
廖飞
杨晓兰
《西安交通大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2019
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