表达绿色荧光蛋白的坦布苏病毒的构建与鉴定

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作者 章丽娇 田宇杰 +9 位作者 张兰香 赵冬敏 韩凯凯 黄欣梅 杨婧 吴凤瑶 刘青涛 刘宇卓 张小飞 李银 《动物医学进展》 北大核心 2024年第6期44-50,共7页

报告病毒在高通量抗病毒药物筛选、活体动物体内成像及新型疫苗研发等方面具有重要应用价值。通过反向遗传操作技术,以坦布苏病毒JXSP株感染性克隆为基础,采用两种策略构建报告病毒,即分别在病毒基因组5′UTR和C蛋白基因、N S5基因和3′... 报告病毒在高通量抗病毒药物筛选、活体动物体内成像及新型疫苗研发等方面具有重要应用价值。通过反向遗传操作技术,以坦布苏病毒JXSP株感染性克隆为基础,采用两种策略构建报告病毒,即分别在病毒基因组5′UTR和C蛋白基因、N S5基因和3′UTR间引入外源基因EGFP,通过融合PCR获得全长cDNA PCR产物,体外转录生成mRNA,转染至BHK-21拯救重组病毒并研究其生长特性。结果显示,利用5′UTR-C位点构建的报告病毒mRNA转染BHK-21细胞后能观察到明显的绿色荧光;报告病毒P0接种DEF细胞后可高强度表达绿色荧光蛋白,在BHK-21和DEF细胞上增殖速度略微低于亲本毒株,但差异不显著。结果表明,成功构建了1株坦布苏绿色荧光报告病毒rJXSP-5′EGFP,在BHK-21和DEF细胞上均能有效增殖。 展开更多

关键词 坦布苏病毒 绿色荧光蛋白 报告病毒

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地黄多糖诱导骨髓间充质干细胞为神经样细胞后的突触功能 被引量：3

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作者 刘宇卓 王霞 +2 位作者 杜红阳 包翠芬 秦书俭 《解剖学杂志》 CAS CSCD 北大核心 2013年第3期285-288,F0003,共5页

目的：探讨地黄多糖诱导大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化为神经元样细胞后是否具有神经突触功能。方法：贴壁筛选法分离纯化BMSCs，地黄多糖进行诱导，激光共聚焦显微镜检测细胞在高钾刺激下细胞膜电位的变化，细胞内钙流变化及细胞... 目的：探讨地黄多糖诱导大鼠骨髓间充质干细胞（BMSCs）分化为神经元样细胞后是否具有神经突触功能。方法：贴壁筛选法分离纯化BMSCs，地黄多糖进行诱导，激光共聚焦显微镜检测细胞在高钾刺激下细胞膜电位的变化，细胞内钙流变化及细胞突触循环功能。结果：地黄多糖诱导24h，连续培养7d后，光学显微镜下显示诱导后的细胞伸出突起交互成复杂网状；免疫荧光细胞化学显示诱导后的细胞神经元巢蛋白阳性表达率为97．9％±1．3％，神经元特异性烯醇化酶阳性率95．4％±1．9％，突触小泡蛋白阳性率为94．2％±2．2％；激光共聚焦显微镜显示诱导后细胞在高钾刺激下细胞膜电位迅速升高，细胞内钙离子流增加，细胞突触发生了胞吞胞吐现象。结论：地黄多糖可以诱导BMSCs分化为神经样细胞，此细胞具有神经细胞的神经生理功能。 展开更多

关键词 骨髓间充质干细胞 地黄多糖 神经性分化 突触功能

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2013年苏皖地区4株H9N2亚型禽流感病毒HA,NA基因的遗传演化分析 被引量：8

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作者 杨婧 刘宇卓 +3 位作者 赵冬敏 黄欣梅 韩凯凯 李银 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第11期1896-1902,共7页

为了解2013年苏皖地区H9N2亚型禽流感病毒的变异情况,选取2013年所分离的4个H9N2亚型禽流感病毒株,对其HA和NA基因进行测序,并应用DNAStar和Mega生物软件拼接序列和建立进化树。结果表明,4株H9N2的HA裂解位点氨基酸均为-R(K)SSR/GL-,具... 为了解2013年苏皖地区H9N2亚型禽流感病毒的变异情况,选取2013年所分离的4个H9N2亚型禽流感病毒株,对其HA和NA基因进行测序,并应用DNAStar和Mega生物软件拼接序列和建立进化树。结果表明,4株H9N2的HA裂解位点氨基酸均为-R(K)SSR/GL-,具有典型低致病性禽流感病毒HA基因的特征;但其226位氨基酸均为亮氨酸(L),呈现出人流感受体结合特性。4株病毒NA基因颈部均有9个核苷酸的缺失,且NA潜在糖基化位点数量不超过8个。进化树分析表明,2013年苏皖地区H9N2流行毒株HA和NA基因发生变异,且变异与时间呈现一定的相关性,与地域无关。 展开更多

关键词 H9N2 HA NA 遗传演化分析

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检测坦布苏病毒病抗体 NS1-ELISA方法的建立与初步应用 被引量：8

4

作者 谢星星 李祥瑞 +5 位作者 李银 赵冬敏 黄欣梅 韩凯凯 刘宇卓 游园 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2014年第1期135-140,共6页

为建立快速检测鸭坦布苏病毒病抗体的血清学方法,本研究利用鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS1基因序列将其克隆至原核表达载体pET32a上,建立重组表达pET32a-NS1,转化至BL21(DE3)中。经IPTG诱导得到NS1融合蛋白,融合蛋白均以包涵体形式... 为建立快速检测鸭坦布苏病毒病抗体的血清学方法,本研究利用鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS1基因序列将其克隆至原核表达载体pET32a上,建立重组表达pET32a-NS1,转化至BL21(DE3)中。经IPTG诱导得到NS1融合蛋白,融合蛋白均以包涵体形式存在,包涵体经过变性和复性,纯化的坦布苏病毒NS1蛋白作为包被抗原,在最佳检测条件基础上,建立了检测坦布苏病毒病(Tembusu virus disease,简称TVD)抗体的间接ELISA方法。结果在条件优化后抗原最适包被量为1.925μg·孔-1,抗原最佳包被条件为37℃放置1 h后4℃过夜,血清的最佳稀释度为1∶200,最佳封闭时间为1 h,酶标二抗最适稀释度为1∶1 000,显色时间10 min。阴阳性临界值判定标准为0.346。用建立的间接ELISA方法检测禽流感、新城疫、传染性支气管炎、TVD阳性血清样品均无交叉反应,表明该方法具有良好的特异性。板内和板间重复试验的最大变异系数分别为6.7%和8.2%,显示该方法具有很好的稳定性。用间接NS1-ELISA方法对81份疑似鸭坦布苏病毒病血清样品进行检测,有43份样品呈现阳性,E-ELISA有48份呈阳性结果,证明该方法具有较高的敏感性。NS1-ELISA方法的建立为TVB的诊断和流行病学调查提供了一种新的方法。 展开更多

关键词 坦布苏病毒 NS1蛋白 间接ELISA 抗体

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鹅源坦布苏病毒 RT-LAMP快速检测方法的建立 被引量：8

5

作者 韩凯凯 李银 +4 位作者 黄欣梅 赵冬敏 刘宇卓 谢星星 游园 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2014年第1期29-33,共5页

坦布苏病毒是新发现的一种可引起家禽产蛋和采食量下降及死亡的黄病毒属病毒。根据GenBank中登录的鹅源坦布苏病毒NS5基因序列,利用Primer Explorer V4软件在序列保守区域设计1套特异识别NS5基因序列中6个不同区段的环介导等温扩增(loop... 坦布苏病毒是新发现的一种可引起家禽产蛋和采食量下降及死亡的黄病毒属病毒。根据GenBank中登录的鹅源坦布苏病毒NS5基因序列,利用Primer Explorer V4软件在序列保守区域设计1套特异识别NS5基因序列中6个不同区段的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)引物,并以此套引物建立一种基于LAMP技术的鹅源坦布苏病毒检测方法。结果表明,该方法灵敏度极高,是普通PCR方法的100倍,只能特异性扩增坦布苏病毒的RNA,对于其他常见禽RNA病毒均无特异性扩增。在反应体系中加入SYBR GreenⅠ染料后,通过肉眼观察有无绿色荧光可直接判定结果。该方法特异性强,灵敏度高,无需特殊仪器,简便,快速,适用于鹅源坦布苏病毒的临床快速检测。 展开更多

关键词 鹅源坦布苏病毒 NS5基因 环介导等温扩增

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鸡源坦布苏病毒(SN01株)的分离与鉴定 被引量：6

6

作者 张敬峰 李银 +3 位作者 赵冬敏 黄欣梅 刘宇卓 钮惠敏 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2013年第5期957-960,共4页

采用SPF鸡胚与vero细胞传代接种法,从江苏某蛋鸡场临床表现为产蛋下降、卵泡萎缩、全身多器官出血为主要特征的发病鸡肝脏、卵巢病料组织中分离一株病毒。该分离毒不能凝集鸡和鹅红细胞,并对乙醚、氯仿敏感;病毒核酸为RNA;PCR结果排除... 采用SPF鸡胚与vero细胞传代接种法,从江苏某蛋鸡场临床表现为产蛋下降、卵泡萎缩、全身多器官出血为主要特征的发病鸡肝脏、卵巢病料组织中分离一株病毒。该分离毒不能凝集鸡和鹅红细胞,并对乙醚、氯仿敏感;病毒核酸为RNA;PCR结果排除了分离毒为禽流感病毒、新城疫病毒、产蛋下降综合征病毒、传染性支气管炎病毒、传染性喉气管炎病毒;用坦布苏病毒特异引物扩增为阳性,序列测定与分析结果显示分离毒与GenBank上登录和实验室保存的坦布苏病毒E基因序列同源性在99%以上。上述结果表明分离毒(SN01)可能是一种新的坦布苏病毒,属于黄病毒科坦布苏病毒属,暂称为鸡源坦布苏病毒。 展开更多

关键词 鸡 坦布苏病毒 SN01株 鉴定

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I型鸭肝炎病毒RT-PCR检测方法的建立 被引量：6

7

作者 魏雪涛 张晓勇 +2 位作者 李银 刘宇卓 张敬峰 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2010年第1期10-13,共4页

根据GenBank发表的DHVI的基因序列,设计了1对针对DHVI保守区的特异性引物。通过对反应条件的优化,建立了鸭病毒性肝炎病毒快速鉴别诊断的RT-PCR方法,扩增片段大小为632bp。试验表明,RT-PCR法具有很强的特异性,且该方法的敏感性明显高于... 根据GenBank发表的DHVI的基因序列,设计了1对针对DHVI保守区的特异性引物。通过对反应条件的优化,建立了鸭病毒性肝炎病毒快速鉴别诊断的RT-PCR方法,扩增片段大小为632bp。试验表明,RT-PCR法具有很强的特异性,且该方法的敏感性明显高于常规的检测方法。对鸭病毒性肝炎的病料检测证明,该方法能有效鉴别DHV,特异性良好。 展开更多

关键词 I型鸭肝炎病毒 RT-PCR 诊断

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鸭瘟病毒PCR检测方法的建立 被引量：3

8

作者 魏雪涛 张晓勇 +3 位作者 李银 刘宇卓 张敬峰 聂文军 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2010年第6期750-753,共4页

根据GenBank发表的鸭瘟病毒(DPV)的基因序列,设计了针对DPV UL6 UL7保守区1对特异性引物。通过对反应条件的优化,建立了鸭瘟病毒快速鉴别诊断的PCR方法,扩增片段大小为1 293 bp。试验结果表明PCR法具有很强的特异性,且敏感性较高,最低DN... 根据GenBank发表的鸭瘟病毒(DPV)的基因序列,设计了针对DPV UL6 UL7保守区1对特异性引物。通过对反应条件的优化,建立了鸭瘟病毒快速鉴别诊断的PCR方法,扩增片段大小为1 293 bp。试验结果表明PCR法具有很强的特异性,且敏感性较高,最低DNA模板检出量为15 pg/mL。对鸭瘟的临床病料检测证明,该方法具有特异、快速和敏感的特点,可有效鉴别DPV。 展开更多

关键词 鸭瘟病毒 PCR 检测

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鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS5的原核表达及特性分析 被引量：1

9

作者 韩凯凯 李银 +5 位作者 黄欣梅 赵冬敏 刘宇卓 刘青涛 谢星星 安凤娇 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第10期1704-1709,共6页

通过在大肠杆菌中表达鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS5对其纯化,并进行特性分析。根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS5基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR技术扩增得到全长NS5基因序列,并将其定向克隆至原核表达载体p ET32a中,获得重组表... 通过在大肠杆菌中表达鹅坦布苏病毒非结构蛋白NS5对其纯化,并进行特性分析。根据鹅坦布苏病毒JS804株非结构蛋白NS5基因序列,设计1对特异性引物,利用PCR技术扩增得到全长NS5基因序列,并将其定向克隆至原核表达载体p ET32a中,获得重组表达质粒p ET32a-NS5,经双酶切鉴定及测序正确后,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中。经IPTG诱导表达,表达的重组融合蛋白最终经SDS-PAGE及Western-blotting鉴定。结果显示,NS5融合蛋白分子质量约为120 ku,在诱导后5 h达到表达量高峰,融合蛋白以包涵体形式存在,Western-blotting显示原核表达的蛋白可被兔抗鹅坦布苏病毒血清特异性识别,表明以NS5蛋白为抗原制备的多克隆抗体具有较高的敏感性与特异性。 展开更多

关键词 鹅坦布苏病毒 NS5蛋白 原核表达

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基于DSP的交流永磁同步电机控制系统设计 被引量：1

10

作者 刘宇卓 《科技创新与应用》 2014年第25期57-57,共1页

随着电力电子技术、微电子技术、电机制造技术、现代控制理论和计算机技术的发展,交流永磁同步电机交流矢量控制系统以其控制精度高、可靠性强等优点得到了广泛的应用。由于受电机参数变化、负载扰动等因素的影响,要获得高性能的永磁同... 随着电力电子技术、微电子技术、电机制造技术、现代控制理论和计算机技术的发展,交流永磁同步电机交流矢量控制系统以其控制精度高、可靠性强等优点得到了广泛的应用。由于受电机参数变化、负载扰动等因素的影响,要获得高性能的永磁同步电机矢量控制系统,必须设计高精度和高可靠的伺服控制器,使系统具有较强的适应性和较强的抗干扰能力。因而,文章研究基于DSP的交流永磁同步电机矢量控制系统。 展开更多

关键词 永磁同步电机 伺服控制器 DSP 矢量控制

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鸡γ干扰素在酵母中的分泌表达

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作者 魏雪涛 李银 +1 位作者 刘宇卓 张敬峰 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2009年第5期450-454,共5页

根据GenBank已发表的鸡γ干扰素(ChIFN-γ)cDNA基因序列设计一对引物,以ConA刺激8 h后的鸡全血淋巴细胞提取的总RNA为模板,通过RT-PCR方法克隆出ChIFN-γ基因,将其连接到pMD18-T载体上获得阳性重组质粒。测序结果表明,该ChIFN-γ与GenB... 根据GenBank已发表的鸡γ干扰素(ChIFN-γ)cDNA基因序列设计一对引物,以ConA刺激8 h后的鸡全血淋巴细胞提取的总RNA为模板,通过RT-PCR方法克隆出ChIFN-γ基因,将其连接到pMD18-T载体上获得阳性重组质粒。测序结果表明,该ChIFN-γ与GenBank上发表的ChIFN-γ序列的同源性可达99.6%,其含有1个495 bp的开放性阅读框架,编码164个氨基酸。通过Kpn I和Not I两个酶切位点将该基因插入酵母表达载体(pPICZa-A),并将该重组酵母ChIFN-γ载体线性化,通过电转化使ChIFN-γ基因整合到酵母(X-33)基因组上,经甲醇诱导后,成功表达出ChIFN-γ。利用Western-blotting分析测定表达的ChIFN-γ蛋白的活性。结果表明,本试验得到的重组酵母ChIFN-γ是具有反应原性的蛋白。 展开更多

关键词 鸡γ干扰素 克隆 分泌表达

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鸭坦布苏病毒病-H9亚型禽流感二联灭活疫苗免疫佐剂筛选 被引量：3

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作者 田宇杰 嵇辛勤 +8 位作者 章丽娇 刘青涛 韩凯凯 杨婧 刘宇卓 赵冬敏 刘娜 王梦瑶 李银 《动物医学进展》 北大核心 2021年第5期26-29,共4页

为筛选出理想的鸭TMUV-AIV(H9亚型)二联灭活疫苗免疫佐剂,将灭活的坦布苏病毒液和禽流感病毒(H9亚型)尿囊液分别与白油佐剂、卡波姆佐剂、铝胶佐剂、蜂胶佐剂制成抗原含量相同的TMUV-AIV二联灭活疫苗。应用阻断ELISA方法和血凝抑制方法... 为筛选出理想的鸭TMUV-AIV(H9亚型)二联灭活疫苗免疫佐剂,将灭活的坦布苏病毒液和禽流感病毒(H9亚型)尿囊液分别与白油佐剂、卡波姆佐剂、铝胶佐剂、蜂胶佐剂制成抗原含量相同的TMUV-AIV二联灭活疫苗。应用阻断ELISA方法和血凝抑制方法测定免疫鸭血清中坦布苏病毒和禽流感病毒抗体,比较不同佐剂疫苗对试验鸭的免疫效力。结果表明,以白油作为佐剂的灭活疫苗组免疫效果最好,抗体产生快、抗体水平优于其他各组,免疫2周后60%(6/10)血清样品HI抗体可达1∶8以上,80%血清样品呈TMUV抗体阳性,是制备鸭TMUV-AIV(H9亚型)二联灭活疫苗的理想佐剂。 展开更多

关键词 坦布苏病毒 禽流感病毒(H9亚型) 佐剂筛选 灭活疫苗

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鹅副粘病毒HN蛋白的原核表达与免疫学鉴定 被引量：2

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作者 李彤彤 李银 +5 位作者 黄欣梅 赵冬敏 刘宇卓 张敬峰 刘飞 李祥瑞 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2012年第2期217-220,共4页

以GenBank登录的鹅源副粘病毒GPMV ZJI株基因组全序列为模板,在HN基因开放阅读框上下游设计一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增得到HN基因,将目的基因克隆至pET32a表达载体上,转化至BL21中,通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定目的蛋白的表... 以GenBank登录的鹅源副粘病毒GPMV ZJI株基因组全序列为模板,在HN基因开放阅读框上下游设计一对特异性引物,利用RT-PCR方法扩增得到HN基因,将目的基因克隆至pET32a表达载体上,转化至BL21中,通过SDS-PAGE和Western-blot鉴定目的蛋白的表达。由结果可知,通过RT-PCR法扩增出HN基因,大小与预期一致。SDS-PAGE和Western-blot均得到预期条带,说明pET32a表达载体在BL21中成功表达了HN蛋白,为后续相关免疫学研究奠定基础。 展开更多

关键词 鹅副粘病毒 HN基因 原核表达

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