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猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用
1
作者
曾苗苗
杨小曼
+9 位作者
张鑫
刘大凯
时洪艳
张记宇
张燎原
陈建飞
冯廷帅
李修文
石达
冯力
《畜牧兽医学报》
北大核心
2025年第1期319-326,共8页
为建立一种猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)血清抗体的快速检测方法,本研究首先经PCR扩增SADS-CoV N基因,纯化鉴定后克隆至表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-N。重组N蛋白诱导表达并通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后,采用...
为建立一种猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)血清抗体的快速检测方法,本研究首先经PCR扩增SADS-CoV N基因,纯化鉴定后克隆至表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-N。重组N蛋白诱导表达并通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后,采用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,以兔抗猪HRP-IgG作为二抗,利用方阵滴定法优化各反应条件,建立了一种以SADS-CoV N蛋白为靶标的检测SADS-CoV血清抗体的间接ELISA方法,并对此方法的敏感性、特异性、重复性及临床应用价值进行鉴定。SDS-PAGE及Western blot结果显示,重组表达的N蛋白约为70 ku,且具有良好的反应原性。采用该方法检测SADS-CoV阳性血清抗体效价可达1∶3 200,并且与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪圆环病毒(PCV)阳性血清均无交叉反应,具有良好的敏感性和特异性。批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,具有较好的重复性。利用该方法和间接免疫荧光方法(IFA)分别对50份猪临床血清样品进行检测,结果显示二者的总符合率为98%。综上,本研究建立了一种基于SADS-CoV N蛋白的间接ELISA抗体检测方法,可用于临床SADS-CoV血清抗体检测以及流行病学的监测,对防控SADS-CoV的流行具有重要意义。
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关键词
猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)
N蛋白
原核表达
间接ELISA
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职称材料
猪急性腹泻综合征冠状病毒SYBR Green荧光定量PCR检测方法的建立及应用
被引量：
8
2
作者
张记宇
韩郁茹
+9 位作者
时洪艳
陈建飞
张鑫
刘建波
张燎原
冯书风
冯廷帅
季朝阳
石达
冯力
《畜牧兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第10期2887-2894,共8页
为建立快速、灵敏且特异的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)检测方法,本试验扩增SADS-CoV N基因保守区域将其克隆至pMD18-T载体。所构建的重组质粒pMD18-T-SADS-qN作为阳性质粒标准品...
为建立快速、灵敏且特异的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)检测方法,本试验扩增SADS-CoV N基因保守区域将其克隆至pMD18-T载体。所构建的重组质粒pMD18-T-SADS-qN作为阳性质粒标准品,以其为模板建立一种SYBR Green荧光定量PCR检测方法。结果显示,所建立方法在3.31×10^(1)~3.31×10^(7)拷贝·μL^(-1)模板量时,呈良好的线性关系,相关系数(R2)为0.997,斜率为-3.318。该方法特异性检测SADS-CoV;而猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)检测结果均为阴性。所构建的标准品检测灵敏度下限可以达到3.31×10^(1)拷贝·μL^(-1),组内和组间变异系数均小于1%,表明其具有良好的灵敏性和重复性。用该方法检测SADS-CoV感染IPI-2I和IPEC-J2细胞后不同时间点和不同接毒剂量的复制情况,结果显示,SADS-CoV感染细胞后2 h病毒含量较低,在12~36 h病毒含量迅速增长,36 h后增长速度减缓且病毒含量维持在较高水平。分别用0、0.1、1 MOI SADS-CoV感染细胞结果显示病毒的mRAN转录水平呈现剂量依赖性增加,当MOI为1时,IPI-2I和IPEC-J2细胞病毒含量分别为10^(6.7)、10^(5.3)拷贝·mL^(-1)。进一步利用所建立的方法对经口服攻毒SADS-CoV仔猪的临床样本进行检测,结果发现病毒在空肠回肠含量较高,表明病毒主要定殖于空肠和回肠。综上表明,本研究建立SYBR Green荧光定量PCR检测方法能灵敏特异地检测SADS-CoV,为SADS-CoV的诊断和病毒相关基础研究提供可靠的检测手段。
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关键词
猪急性腹泻综合征病毒
N基因
荧光定量PCR
检测
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职称材料
题名
猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用
1
作者
曾苗苗
杨小曼
张鑫
刘大凯
时洪艳
张记宇
张燎原
陈建飞
冯廷帅
李修文
石达
冯力
机构
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所
出处
《畜牧兽医学报》
北大核心
2025年第1期319-326,共8页
基金
国家自然科学基金区域创新发展联合基金(U23A20236)
中央级公益性科研院所基本科研业务费专项(1610302022015)。
文摘
为建立一种猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)血清抗体的快速检测方法,本研究首先经PCR扩增SADS-CoV N基因,纯化鉴定后克隆至表达载体pET-32a(+),构建重组质粒pET-32a-N。重组N蛋白诱导表达并通过SDS-PAGE和Western blot鉴定后,采用纯化的重组N蛋白作为包被抗原,以兔抗猪HRP-IgG作为二抗,利用方阵滴定法优化各反应条件,建立了一种以SADS-CoV N蛋白为靶标的检测SADS-CoV血清抗体的间接ELISA方法,并对此方法的敏感性、特异性、重复性及临床应用价值进行鉴定。SDS-PAGE及Western blot结果显示,重组表达的N蛋白约为70 ku,且具有良好的反应原性。采用该方法检测SADS-CoV阳性血清抗体效价可达1∶3 200,并且与猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪丁型冠状病毒(PDCoV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(PRRSV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪圆环病毒(PCV)阳性血清均无交叉反应,具有良好的敏感性和特异性。批内和批间重复性试验的变异系数均小于10%,具有较好的重复性。利用该方法和间接免疫荧光方法(IFA)分别对50份猪临床血清样品进行检测,结果显示二者的总符合率为98%。综上,本研究建立了一种基于SADS-CoV N蛋白的间接ELISA抗体检测方法,可用于临床SADS-CoV血清抗体检测以及流行病学的监测,对防控SADS-CoV的流行具有重要意义。
关键词
猪急性腹泻综合征冠状病毒(SADS-CoV)
N蛋白
原核表达
间接ELISA
Keywords
swine acute diarrhea syndrome coronavirus(SADS-CoV)
N protein
prokaryotic expression
indirect ELISA
分类号
S852.659.6 [农业科学—基础兽医学]
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职称材料
题名
猪急性腹泻综合征冠状病毒SYBR Green荧光定量PCR检测方法的建立及应用
被引量：
8
2
作者
张记宇
韩郁茹
时洪艳
陈建飞
张鑫
刘建波
张燎原
冯书风
冯廷帅
季朝阳
石达
冯力
机构
中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室猪消化道传染病创新团队
出处
《畜牧兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021年第10期2887-2894,共8页
基金
黑龙江省自然科学基金研究团队项目(TD2020C002)
黑龙江省自然科学基金(C2018066)。
文摘
为建立快速、灵敏且特异的检测猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)检测方法,本试验扩增SADS-CoV N基因保守区域将其克隆至pMD18-T载体。所构建的重组质粒pMD18-T-SADS-qN作为阳性质粒标准品,以其为模板建立一种SYBR Green荧光定量PCR检测方法。结果显示,所建立方法在3.31×10^(1)~3.31×10^(7)拷贝·μL^(-1)模板量时,呈良好的线性关系,相关系数(R2)为0.997,斜率为-3.318。该方法特异性检测SADS-CoV;而猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)和猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)检测结果均为阴性。所构建的标准品检测灵敏度下限可以达到3.31×10^(1)拷贝·μL^(-1),组内和组间变异系数均小于1%,表明其具有良好的灵敏性和重复性。用该方法检测SADS-CoV感染IPI-2I和IPEC-J2细胞后不同时间点和不同接毒剂量的复制情况,结果显示,SADS-CoV感染细胞后2 h病毒含量较低,在12~36 h病毒含量迅速增长,36 h后增长速度减缓且病毒含量维持在较高水平。分别用0、0.1、1 MOI SADS-CoV感染细胞结果显示病毒的mRAN转录水平呈现剂量依赖性增加,当MOI为1时,IPI-2I和IPEC-J2细胞病毒含量分别为10^(6.7)、10^(5.3)拷贝·mL^(-1)。进一步利用所建立的方法对经口服攻毒SADS-CoV仔猪的临床样本进行检测,结果发现病毒在空肠回肠含量较高,表明病毒主要定殖于空肠和回肠。综上表明,本研究建立SYBR Green荧光定量PCR检测方法能灵敏特异地检测SADS-CoV,为SADS-CoV的诊断和病毒相关基础研究提供可靠的检测手段。
关键词
猪急性腹泻综合征病毒
N基因
荧光定量PCR
检测
Keywords
swine acute diarrhea syndrome coronavirus(SADS-CoV)
N gene
real-time PCR
detection
分类号
S852.659.6 [农业科学—基础兽医学]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
猪急性腹泻综合征冠状病毒N蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立及初步应用
曾苗苗
杨小曼
张鑫
刘大凯
时洪艳
张记宇
张燎原
陈建飞
冯廷帅
李修文
石达
冯力
《畜牧兽医学报》
北大核心
2025
0
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职称材料
2
猪急性腹泻综合征冠状病毒SYBR Green荧光定量PCR检测方法的建立及应用
张记宇
韩郁茹
时洪艳
陈建飞
张鑫
刘建波
张燎原
冯书风
冯廷帅
季朝阳
石达
冯力
《畜牧兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2021
8
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