浙江省地方品种鸡禽白血病的流行病学调查与净化策略评估

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作者 倪征 卢磊 +7 位作者 朱寅初 陈柳 李鑫基 叶伟成 云涛 华炯钢 付媛 张存 《浙江农业学报》 北大核心 2025年第4期790-799,共10页

为了解浙江省部分地方品种鸡禽白血病病毒(ALV)的感染情况,并评估禽白血病(AL)净化效果,本研究于2021—2024年采集浙江省6种地方品种鸡的雏鸡胎粪、母鸡蛋清与公鸡血浆样本合计163453份,通过检测ALV p27抗原的阳性率分析ALV的感染情况,... 为了解浙江省部分地方品种鸡禽白血病病毒(ALV)的感染情况,并评估禽白血病(AL)净化效果,本研究于2021—2024年采集浙江省6种地方品种鸡的雏鸡胎粪、母鸡蛋清与公鸡血浆样本合计163453份,通过检测ALV p27抗原的阳性率分析ALV的感染情况,并进行连续3个世代的AL净化,评估净化效果。同时,对阳性样品进行病毒的分离鉴定和组织病理学检查,通过扩增分离株的囊膜糖蛋白gp 85基因,对分离的ALV进行了遗传进化分析。研究结果显示,被调查的6种地方品种鸡均存在ALV感染,p27抗原的群体平均阳性率为10.02%,其中,白耳黄鸡的阳性率最高,为43.87%。经过3个世代的净化,各样本的阳性率均明显下降,但不同品种的下降幅度差异明显,江山乌骨鸡的净化效果最优,3个世代后蛋清和血浆的阳性率均为0。从阳性样本中分离到2株ALV(ZJU2401和ZJU2402),经进化树分析均属于J亚群。研究结果表明,本净化方案切实可行,研究结果可为浙江省地方品种鸡群AL的净化和防控工作提供参考依据和数据支持。 展开更多

关键词 禽白血病 净化效果评估 gp 85基因 遗传进化

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禽痘病毒SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立

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作者 叶伟成 陈柳 +6 位作者 倪征 云涛 华炯钢 霍苏馨 付媛 张存 朱寅初 《中国预防兽医学报》 北大核心 2025年第8期813-819,共7页

为建立禽痘病毒(APV)快速灵敏的荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究经PCR扩增鸡痘病毒(FPV,APV中的主要病毒)高度保守核心基因P4b,构建重组质粒标准品pMD19-FPV-P4b,经PCR与测序鉴定正确后作为模板,采用设计的qPCR通用型引物FPV-JC-F/R(... 为建立禽痘病毒(APV)快速灵敏的荧光定量PCR(qPCR)检测方法,本研究经PCR扩增鸡痘病毒(FPV,APV中的主要病毒)高度保守核心基因P4b,构建重组质粒标准品pMD19-FPV-P4b,经PCR与测序鉴定正确后作为模板,采用设计的qPCR通用型引物FPV-JC-F/R(根据分析比对不同种属27种APV A分支高度保守的核心基因P4b设计),利用方阵法优化各反应条件,初步建立检测APV的qPCR方法。将重组质粒pDM19-FPV-P4b 10倍倍比稀释后作为模板,利用优化的反应条件经qPCR扩增,以拷贝数的对数值为纵坐标,Ct值为横坐标绘制标准曲线,结果显示,标准曲线的R^(2)为0.9995,质粒标准品在3.53拷贝/μL~3.53×10^(8)拷贝/μL范围内与各自的Ct值呈良好的线性关系。采用建立的qPCR方法检测APV及禽类常见病毒,评估其特异性;采用该qPCR和常规PCR方法分别检测10倍倍比稀释的FPV弱毒疫苗(9.75×10^(6)TCID_(50)/mL~9.75×10^(-1)TCID_(50)/mL)及质粒标准品(3.53×107拷贝/μL~3.53拷贝/μL),评估该方法的敏感性;以不同浓度的质粒标准品作为模板,于同一时间和不同时间分别利用该qPCR方法检测,评估该方法的重复性。结果显示,除FPV与鸽痘病毒(PPV)检测结果为阳性外,新城疫病毒(NDV)、H9亚型禽流感病毒(H9 AIV)、鸡传染性法氏囊病毒(IBDV)、鸡传染性喉气管炎病毒(ILTV)、禽腺病毒4型(FAdV-4)、火鸡疱疹病毒(HVT)等均为阴性结果,特异性强;该方法对FPV弱毒疫苗与质粒标准品的检测限分别为9.75 TCID_(50)/mL和3.53拷贝/μL,常规PCR对FPV弱毒疫苗和质粒标准品的检测限分别为975 TCID_(50)/mL和3.53×10^(2)拷贝/μL,组内组间重复性试验的变异系数均小于1.57%,重复性好。采用该方法和常规PCR方法同时检测186份临床疑似患鸡痘鸡的病料样品(鸡咽喉部痘疱结节、痘痂样品41份;肺、肝、肾脏样品各32份;咽拭子样品49份),结果显示,qPCR的阳性检出率为65.1%(121/186),常规PCR的阳性检出率为55.9%(104/186),二者检测结果的阳性符合率、阴性符合率与总符合率分别为100%、79.3%(65/82)与90.9%(169/186)。综上,本研究建立的检测APV的qPCR方法特异性强、敏感性高、重复性和稳定性好、适用范围更广,可以用于临床各种样品的快速检测,为APV的临床检测和流行病学调查提供了一种便捷的新的技术手段。 展开更多

关键词 禽痘病毒 SYBR Green I 荧光定量PCR 临床检测

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鸡痘病毒ORF127蛋白间接ELISA抗体检测方法的建立与应用

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作者 华炯钢 朱寅初 +6 位作者 叶加林 张存 陈柳 倪征 付媛 霍苏馨 云涛 《浙江农业学报》 北大核心 2025年第10期2057-2065,共9页

为建立快速、准确的鸡痘病毒(fowlpox virus,FPV)抗体检测方法,将FPV ORF127基因的抗原表位区域克隆于pET-28a(+)原核表达载体,诱导表达并纯化获得FPV ORF127截短蛋白,以纯化的蛋白作为包被抗原,通过优化各反应条件,建立检测FPV抗体的间... 为建立快速、准确的鸡痘病毒(fowlpox virus,FPV)抗体检测方法,将FPV ORF127基因的抗原表位区域克隆于pET-28a(+)原核表达载体,诱导表达并纯化获得FPV ORF127截短蛋白,以纯化的蛋白作为包被抗原,通过优化各反应条件,建立检测FPV抗体的间接ELISA方法,经特异性、敏感性、重复性等试验和临床血清样本检测进行系统验证。结果显示,间接ELISA检测FPV抗体的最佳反应条件为:包被抗原质量浓度为10μg·mL^(-1),待检血清稀释度为1∶100,酶标二抗稀释度为1∶25000;特异性试验结果显示,除FPV阳性血清呈阳性反应外,与其他6种病毒(新城疫病毒、H9亚型禽流感病毒、鸡传染性法氏囊病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、禽腺病毒4型、火鸡疱疹病毒)的阳性血清均无交叉反应;敏感性结果显示,FPV阳性血清稀释800倍后检测结果仍为阳性;批内、批间重复试验结果显示,批内变异系数为1.81%~7.07%,批间变异系数为2.12%~7.16%,均小于10%。临床血清样品检测结果显示,180份血清样本总阳性率为79.4%(143/180)。上述结果表明,本研究建立的间接ELISA方法特异性强、敏感性高、重复性和稳定性好,可为免疫鸡群FPV抗体水平监测和FPV流行病学调查提供技术支撑。 展开更多

关键词 鸡痘病毒 ORF127蛋白 间接ELISA 抗体

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鸭瘟病毒疫苗株UL35缺失株的构建及其免疫保护效果评价

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作者 陈柳 相生瑞 +5 位作者 云涛 倪征 华炯钢 朱寅初 张存 叶伟成 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第8期3933-3941,共9页

为研究鸭瘟病毒(duck enteritis virus,DEV)UL35基因缺失DEV疫苗株的生物学特性和对强毒株攻击的免疫保护效果,本研究在鸭瘟病毒疫苗株感染性克隆pDEV-EF1基础上,通过“Red E/T两步重组”技术,构建了UL35基因缺失的pDEV-ΔVP26突变体克... 为研究鸭瘟病毒(duck enteritis virus,DEV)UL35基因缺失DEV疫苗株的生物学特性和对强毒株攻击的免疫保护效果,本研究在鸭瘟病毒疫苗株感染性克隆pDEV-EF1基础上,通过“Red E/T两步重组”技术,构建了UL35基因缺失的pDEV-ΔVP26突变体克隆,并转染鸡胚成纤维细胞(CEFs)获得了重组病毒rDEV-ΔVP26,进而对重组病毒细胞生物学特性和免疫保护能力进行了评估。病毒一步生长曲线测定表明,rDEV-ΔVP26的滴度从24~84 h稳步上升,达到峰值10^(5.36)TCID_(50)·0.1 mL^(-1)。在此期间,rDEV-ΔVP26滴度较亲本毒株rDEV-EF1相比有所降低。蚀斑面积测定发现rDEV-ΔVP26蚀斑面积较亲本株rDEV-EF1减少了10.60%,说明UL35基因缺失会轻微影响病毒扩散并降低病毒滴度。动物试验表明,1×10^(6)TCID_(50)的rDEV-ΔVP26对30日龄麻鸭无致病作用,且1×10^(5)TCID_(50)滴度的rDEV-ΔVP26免疫组在强毒株攻击下的保护率与相同剂量的rDEV-EF1对照组一致。该研究表明,UL35为DEV复制非必需基因,且当接种合适剂量的病毒液时,UL35缺失不影响鸭瘟病毒疫苗株的免疫保护效果。该研究为研发用于区分疫苗免疫和野毒感染的DEV鉴别诊断疫苗奠定了基础。 展开更多

关键词 鸭瘟病毒 VP26 非必需基因 鉴别诊断

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4种胶体金免疫层析法诊断布鲁氏菌病的应用比较和分析评价

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作者 林瑞平 袁曾壮 +4 位作者 李俊鸿 庄定能 沈莹 冯高乐 倪征 《中国动物传染病学报》 北大核心 2025年第2期111-116,共6页

为了筛选出适合的检测方法,提高基层实验室的检测诊断能力,从而在源头上做好动物布鲁氏菌病的诊断和净化工作。本研究分别通过敏感度、特异度、Youden指数、漏诊率以及误诊率等不同参数评价了4家公司的布鲁氏菌病抗体检测胶体金试剂盒... 为了筛选出适合的检测方法,提高基层实验室的检测诊断能力,从而在源头上做好动物布鲁氏菌病的诊断和净化工作。本研究分别通过敏感度、特异度、Youden指数、漏诊率以及误诊率等不同参数评价了4家公司的布鲁氏菌病抗体检测胶体金试剂盒的性能,同时以虎红平板凝集试验作为参照方法。结果显示:4家公司的胶体金试剂盒的特异度均为100%,其中B公司对标准阳性血清样品的最低检出浓度可达1∶512,且灵敏度和Youden指数均最高,可达86.67%,说明其证实疾病的能力越强。A公司和C公司的最低检出浓度为1∶256,而虎红平板凝集试验对标准阳性血清样品的最低检出浓度仅为1∶4,表明其对阳性样本初筛敏感度较低。本实验结果表明,胶体金层析法可以作为基层布病初筛的一种可靠的检测方法,也为诊断试剂盒选择提供参考数据,为布鲁氏菌病的防控提供一种可靠的检测技术。 展开更多

关键词 布鲁氏菌病 虎红平板凝集试验 胶体金试纸条 敏感性 比较分析

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基于智能环境监测的蛋鸭环保型网床养殖圈舍设计及应用 被引量：7

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作者 倪征 陈柳 +4 位作者 云涛 叶伟成 华炯钢 朱寅初 张存 《中国家禽》 北大核心 2022年第2期70-76,共7页

为解决传统蛋鸭养殖方式对自然水源和生态环境的污染,以及对水体、土地、垫草等资源依赖的瓶颈问题,研究结合无线传感器的环境监控系统,设计了一种基于环境智能监控的环保型全封闭蛋鸭旱养圈舍,并结合饲养情况对旱养系统内部的自动化配... 为解决传统蛋鸭养殖方式对自然水源和生态环境的污染,以及对水体、土地、垫草等资源依赖的瓶颈问题,研究结合无线传感器的环境监控系统,设计了一种基于环境智能监控的环保型全封闭蛋鸭旱养圈舍,并结合饲养情况对旱养系统内部的自动化配套设施、圈舍通风、网床布局、内部活动区以及产蛋区的规划以及饲养条件等进行优化。初步应用结果显示:与传统地面平养相比,环保型全封闭蛋鸭旱养圈舍养殖有利于提高蛋鸭生产性能,产蛋高峰期持续时间长,全程料蛋比2.89∶1,高峰期料蛋比2.69∶1,每只蛋鸭养殖效益增加将近22元。该设计为水禽旱养的规范化方案提供了理论依据,具有实际推广价值,并有利于实现水禽产业的可持续发展。 展开更多

关键词 蛋鸭 智能环境监测 网床 旱养技术

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浙江省地方鸡种禽白血病毒抗原检测与部分分离株GP85基因序列分析 被引量：3

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作者 倪征 陈柳 +4 位作者 华炯钢 叶伟成 云涛 朱寅初 张存 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2020年第8期1357-1362,共6页

为了解浙江地区地方品种鸡中J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis vrius,ALV-J)的感染情况与流行毒株的分子特征,对浙江省部分地方品种鸡体内ALV的p27抗原进行了检测,从疑似感染鸡群中检测分离到5株ALV-J,并对其GP85基因进行PC... 为了解浙江地区地方品种鸡中J亚群禽白血病病毒(subgroup J avian leukosis vrius,ALV-J)的感染情况与流行毒株的分子特征,对浙江省部分地方品种鸡体内ALV的p27抗原进行了检测,从疑似感染鸡群中检测分离到5株ALV-J,并对其GP85基因进行PCR分子克隆和序列分析。研究结果显示:在检测的19个地方鸡品系中,所有品系的鸡样本都呈现抗原阳性,其中101系的抗体阳性率最高,母鸡阳性率为40.48%,公鸡阳性率为16.54%;126系次之,母鸡阳性率为28.87%,公鸡阳性率为3.30%;171系抗体阳性率最低,其母鸡阳性率仅为4.08%,公鸡的感染率为0。为了解地方鸡群中ALV-J的遗传变异,对分离到的5株ALV-J的GP85基因进行了分子克隆和序列分析。结果表明,5个分离毒株的GP85基因大小均为924 bp,与预期一致;本研究样品序列之间的核苷酸同源性为90.8%~98.5%,与原型毒株HPRS103核苷酸相似性为90.3%~97.0%,与国内其他分离株的同源性为86.5%~99.0%。分离株与福建(FJ201308株)和广东(WF13株)分离株的同源性最高。结果表明:浙江省大部分地方品种鸡都不同程度感染ALV-J,而且分离毒株已经发生了不同程度的变异,提示我们应加强浙江省地方品种鸡ALV的净化工作。 展开更多

关键词 禽白血病病毒 P27抗原 GP85基因 序列分析

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1株伪狂犬病病毒的基因变异及其对小鼠的致病性分析 被引量：1

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作者 倪征 叶伟成 +4 位作者 陈柳 云涛 华炯钢 朱寅初 张存 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2023年第4期1766-1770,共5页

本研究旨在了解我国猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)流行毒株的分子遗传变异及毒力特点。对1株分离自1个接种了Bartha-K61疫苗的规模猪场的PRV ZJ株进行了主要糖蛋白基因序列(gB、gC和gE)的测定分析及对6周龄BALB/c小鼠的致病... 本研究旨在了解我国猪伪狂犬病病毒(pseudorabies virus,PRV)流行毒株的分子遗传变异及毒力特点。对1株分离自1个接种了Bartha-K61疫苗的规模猪场的PRV ZJ株进行了主要糖蛋白基因序列(gB、gC和gE)的测定分析及对6周龄BALB/c小鼠的致病性研究。遗传变异分析显示,该毒株与我国2012年后的流行毒株高度同源,具有变异毒株基因特征,但gE基因的510位氨基酸出现了不同于变异株的独特变化S^(510) G。ZJ株对小鼠具有较高的致病性,攻毒小鼠呈现典型的神经症状,以100 LD_(50)感染小鼠,第5天死亡率达100%。本研究为进一步探索该病毒的毒株变异特点与致病机理奠定基础。 展开更多

关键词 伪狂犬病病毒 变异株 遗传变异 致病性

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兔病毒性出血症病毒中国株(JX/CHA/97)全基因组分子克隆及序列分析 被引量：1

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作者 倪征 方维焕 +3 位作者 张玉颖 云涛 陈锦清 刘光清 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2006年第6期668-671,675,共5页

本研究首次完成了兔病毒性出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)中国分离株JX/CHA/97全基因组序列的测定与分析。研究结果表明,JX/CHA/97株的全基因组由7437个核苷酸组成,其基因组构成为：5′端有一个长度仅为9nt的非编码... 本研究首次完成了兔病毒性出血症病毒(Rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)中国分离株JX/CHA/97全基因组序列的测定与分析。研究结果表明,JX/CHA/97株的全基因组由7437个核苷酸组成,其基因组构成为：5′端有一个长度仅为9nt的非编码区,随后有2个阅读框架(ORFs),分别编码一个聚合蛋白和一个结构蛋白。在基因组的3′端也有一个非编码区,长度为59nt。另外,采用RACE方法获得了RHDV的poly (A)尾序,证明该结构至少含有27个A。根据RHDV衣壳蛋白的基因序列,将JX/CHA/97株与来自世界各地的22株RHDV分离株的基因组序列进行了比较与分析,并绘制了系统发生树。结果表明,RHDV各分离株之间存在较高的序列同源性,可以将它们至少分为6个拓朴群,提示RHDV有朝不同方向发生进化的趋势。 展开更多

关键词 兔病毒性出血症病毒 JX/CHA/97株 克隆 序列分析

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转译过程中小RNA病毒与宿主细胞的相互作用

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作者 倪征 刘光清 +4 位作者 云涛 梁华丽 华炯刚 李双茂 杜青云 《浙江农业学报》 CSCD 2005年第6期398-403,共6页

小RNA病毒的转译机制不同于真核细胞mRNA的转译机制,该类病毒是借助于内部核糖体进入位点来启动内部翻译过程的,同时还伴随着宿主细胞蛋白质合成的抑制过程。在此过程中,小RNA病毒与宿主细胞间发生了一系列复杂的相互作用和信息交流,本... 小RNA病毒的转译机制不同于真核细胞mRNA的转译机制,该类病毒是借助于内部核糖体进入位点来启动内部翻译过程的,同时还伴随着宿主细胞蛋白质合成的抑制过程。在此过程中,小RNA病毒与宿主细胞间发生了一系列复杂的相互作用和信息交流,本文对该领域的研究进展作了综述。 展开更多

关键词 小RNA病毒 内部核糖体进入位点 宿主细胞

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基于模式病毒评价商品化消毒剂对非洲猪瘟病毒的消杀效果

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作者 倪征 朱寅初 +6 位作者 孙冰冰 云涛 陈柳 徐辉 叶伟成 华炯钢 张存 《浙江农业科学》 2024年第8期1944-1949,共6页

为了解常用商品化消毒剂对非洲猪瘟病毒(ASFV)的消杀效果,为其消毒剂的筛选提供参考。该研究利用伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)与ASFV病毒理化特征的相似性,以PRV作为替代标识毒株,建立了消毒剂细胞评价模型,于体外检测了3种市售... 为了解常用商品化消毒剂对非洲猪瘟病毒(ASFV)的消杀效果,为其消毒剂的筛选提供参考。该研究利用伪狂犬病毒(pseudorabies virus,PRV)与ASFV病毒理化特征的相似性,以PRV作为替代标识毒株,建立了消毒剂细胞评价模型,于体外检测了3种市售消毒剂对生长在BHK-21细胞中PRV的灭活效果。分别从3类消毒剂的不同方面对消毒剂抗病毒作用的影响进行消杀效果的评估。研究显示,有效含量为0.125 g·L^(-1)的戊二醛癸甲溴铵溶液,以及有效含量为0.5 g·L^(-1)的过氧乙酸溶液和二氯异氰脲酸钠,在室温作用30 min,均可有效灭活PRV。其中,过氧乙酸综合评价最优;戊二醛癸甲溴铵性价比最高,但所需消杀时间较长,受低温影响比较严重。该研究可为养殖场防控ASFV的感染提供消毒剂筛选的理论依据,并对ASFV的消毒标准提供参考。 展开更多

关键词 消毒剂细胞评价模型 ASFV PRV 杀灭病毒效果

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玻璃瓶在线检测系统设计 被引量：7

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作者 倪征 苏光大 +1 位作者 马惠敏 王俊艳 《计算机工程与应用》 CSCD 北大核心 2004年第3期218-220,共3页

该文设计了一个玻璃瓶在线检测系统,用8个普通摄像机在线获取运行中的玻璃瓶瓶口图像,采用遮光箱内局部照明方式,用图像采集卡完成视频信号的计算机输入,两台计算机分别处理4个摄像头的图像,经过计算机之间的通讯完成数据综合,由服务器... 该文设计了一个玻璃瓶在线检测系统,用8个普通摄像机在线获取运行中的玻璃瓶瓶口图像,采用遮光箱内局部照明方式,用图像采集卡完成视频信号的计算机输入,两台计算机分别处理4个摄像头的图像,经过计算机之间的通讯完成数据综合,由服务器给出最终检测结果。 展开更多

关键词 玻璃瓶检测 在线检测系统 图像获取 缺陷识别 系统控制

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猪圆环病毒II型结构蛋白的二级结构及其B细胞抗原表位预测 被引量：15

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作者 刘光清 倪征 +4 位作者 云涛 梁华丽 华炯刚 李双茂 杜清云 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2005年第6期462-464,共3页

本研究以猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)II型的基因组序列为材料,采用Garnier-Robson方法、Chou-Farplus方法和Karplus-Schulz方法预测了其结构蛋白的二级结构,用Kyte-Doolittle方法对结构蛋白的亲水性进行了分析,用Emini方法预测... 本研究以猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)II型的基因组序列为材料,采用Garnier-Robson方法、Chou-Farplus方法和Karplus-Schulz方法预测了其结构蛋白的二级结构,用Kyte-Doolittle方法对结构蛋白的亲水性进行了分析,用Emini方法预测了结构蛋白的表面可能性,以Jameson-Wolf方法预测了蛋白的抗原指数。然后综合评价了PCV-2型结构蛋白的B细胞抗原表位。结果表明,PCV-2结构蛋白形成α螺旋结构的能力较差,但是该蛋白含有较多的β折叠和转角结构,因而该蛋白具有丰富的二级结构。分析结果还表明结构蛋白具有多处抗原指数较高的区段,其中羧基端含有潜在的B细胞优势抗原表位,因此其在免疫学中的地位也应当引起重视。本研究将为猪圆环病毒的反向疫苗学的研究提供一定的理论依据。 展开更多

关键词 口蹄疫病毒 结构蛋白 B细胞表位 二级结构

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兔病毒性出血症病毒基因组3′端非编码区的分子克隆及生物信息学分析 被引量：12

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作者 刘光清 张玉颖 +7 位作者 云涛 倪征 张淼涛 梁华丽 华炯刚 李双茂 杜青云 盛祖恬 《西北农林科技大学学报（自然科学版）》 CSCD 北大核心 2006年第3期16-20,25,共6页

采用3′RACE方法对兔病毒性出血症病毒(RHDV)JX／CHA／97株基因组3′端全序列进行了扩增、克隆和测序,并利用ONAstar和DNAman软件分析了RHDV JX／CHA／97株与各参比毒株3′NCR的序列同源性,用RNA structure软件对3′NCR的二级结构进行... 采用3′RACE方法对兔病毒性出血症病毒(RHDV)JX／CHA／97株基因组3′端全序列进行了扩增、克隆和测序,并利用ONAstar和DNAman软件分析了RHDV JX／CHA／97株与各参比毒株3′NCR的序列同源性,用RNA structure软件对3′NCR的二级结构进行了预测和分析。结果表明,所扩增的目的基因片段长1500 bp,包括部分VP60基因序列、ORF2基因、3′端非编码区(3′Non Coding Region,3′NCR)和poly(A)尾巴,其中 3′NCR位于ORF2终止密码子TAG之后,长59 bp,poly(A)至少含有27个A;3′NCR序列具有较高的同源性 (93．5％-100％);3′NCR二级结构可以形成2个潜在的茎-环结构(SL1和SL2),其中SL2具有一定的保守性,其形状和形成位置与poly(A)尾巴的长度关系不大,但是SL1的结构和形成位置与poly(A)尾巴的存在与否密切相关,提示poly(A)尾巴与3′NCR高级结构的稳定性以及基因组复制有一定关系。 展开更多

关键词 兔病毒性出血症病毒 3’端非编码区 POLY(A) 二级结构 生物信息学

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新型番鸭呼肠孤病毒σC蛋白的原核表达及其抗原特性 被引量：11

15

作者 陈海鹏 云涛 +4 位作者 张存 余斌 倪征 华炯钢 崔言顺 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2014年第6期1448-1452,共5页

新型番鸭呼肠孤病毒是近年来新发现的一种引起鸭严重疾病的病原,该病毒与经典MDRV主要在病毒宿主范围、体外培养特性、临床致病性和免疫保护特性上存在显著的差异。通过RT-PCR扩增新型呼肠孤病毒σC基因,经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切处理,插入... 新型番鸭呼肠孤病毒是近年来新发现的一种引起鸭严重疾病的病原,该病毒与经典MDRV主要在病毒宿主范围、体外培养特性、临床致病性和免疫保护特性上存在显著的差异。通过RT-PCR扩增新型呼肠孤病毒σC基因,经NcoⅠ和XhoⅠ双酶切处理,插入到p ET-28a(+)原核表达载体,获得重组质粒p ET-28a(+)-σC。将重组阳性质粒转化至BL21(DE3)感受态细胞,诱导表达后经SDS-PAGE电泳对σC蛋白进行初步分析,蛋白分子量约为36 k Da。重组蛋白经纯化后免疫实验兔,获得抗σC蛋白的高效免疫血清。通过Western Blot与间接免疫荧光实验初步表明,新型鸭呼肠孤病毒σC蛋白具有良好的反应活性。 展开更多

关键词 新型呼肠孤病毒 σC基因 原核表达 兔抗血清

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兔出血症病毒衣壳蛋白VP60在杆状病毒表达系统中的表达及细胞内定位 被引量：6

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作者 陈柳 云涛 +3 位作者 刘光清 倪征 余斌 宋毅 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2010年第2期135-139,共5页

为了探讨兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白的细胞内定位,利用杆状病毒表达系统构建了表达RHDV结构蛋白(VP60)的重组杆状病毒。间接免疫荧光(IFA)和Western blot检测以及电子显微镜观察结果表明,VP60不仅能在昆虫细胞中正确表达,而且能自组装... 为了探讨兔出血症病毒(RHDV)衣壳蛋白的细胞内定位,利用杆状病毒表达系统构建了表达RHDV结构蛋白(VP60)的重组杆状病毒。间接免疫荧光(IFA)和Western blot检测以及电子显微镜观察结果表明,VP60不仅能在昆虫细胞中正确表达,而且能自组装形成病毒样颗粒(VLPs)。进一步对表达蛋白进行细胞内定位观察发现,表达蛋白定位于Sf9细胞的细胞膜上。 展开更多

关键词 兔出血症病毒 结构蛋白 昆虫—杆状病毒表达系统 细胞内定位

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新型鸭呼肠孤病毒σB蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定 被引量：5

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作者 华炯钢 叶伟成 +4 位作者 倪征 陈柳 朱寅初 云涛 张存 《中国预防兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2022年第4期428-434,共7页

B蛋白是新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)的外衣壳蛋白之一,可诱导宿主机体产生群特异性抗体。为制备NDRVσB蛋白的单克隆抗体(MAb),并鉴定其抗原表位,本研究利用原核表达后纯化的重组σB蛋白(rσB)免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合... B蛋白是新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)的外衣壳蛋白之一,可诱导宿主机体产生群特异性抗体。为制备NDRVσB蛋白的单克隆抗体(MAb),并鉴定其抗原表位,本研究利用原核表达后纯化的重组σB蛋白(rσB)免疫BALB/c小鼠,取其脾淋巴细胞与SP2/0细胞融合,以纯化的rσB为包被抗原,通过间接ELISA方法筛选出3株杂交瘤细胞,其分泌的MAb分别命名为10-A5、A1-A9和B7-E5。将NDRV ZJ00M株以MOI 0.01感染DF-1细胞72 h后收获细胞,通过western blot鉴定获得的MAb与天然表达的σB蛋白的反应性;分别将NDRV ZJ00M株、鸭经典呼肠孤病毒(CDRV)ZJ2000M株和鸡呼肠孤病毒(ARV)S1133株均以MOI 0.01感染DF-1细胞,48 h后经间接免疫荧光试验(IFA)鉴定MAb的交叉反应性。Western blot结果显示,3株MAb均在41 ku出现特异性条带,表明其均能够与NDRVσB蛋白发生特异性反应;IFA结果显示:3株MAb均与NDRV反应,而不与CDRV和ARV发生交叉反应。上述结果表明,本研究制备的MAb反应原性和特异性均较强。利用人工合成的37条NDRVσB蛋白多肽及其截短的多肽,采用肽扫描法结合间接ELISA方法对3株MAb识别的抗原表位进行鉴定,并通过抗原表位氨基酸序列比对,分析该抗原表位在禽正呼肠孤病毒各成员中的保守性。结果显示,3株MAb识别的最小抗原表位均为33DIEEFHTPDVI43,且该抗原表位氨基酸序列在不同地域和不同宿主来源的NDRV分离株间的保守性均较高。本研究首次制备了NDRVσB蛋白的MAb,并鉴定了其抗原表位及该表位的保守性,为NDRV检测方法和表位标记疫苗的研究奠定基础。 展开更多

关键词 新型鸭呼肠孤病毒 σB蛋白 单克隆抗体 抗原表位

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鸭坦布苏病毒E蛋白线性化B细胞抗原表位的鉴定 被引量：5

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作者 张琳 余斌 +6 位作者 倪征 陈柳 云涛 叶伟成 华炯钢 崔言顺 张存 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2017年第12期2009-2014,共6页

为鉴定鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)的B细胞抗原表位,以纯化的DTMUV YY5株为抗原制备了2株单克隆抗体AE4和BD10,研究证实BD10为线性化表位,其结合的抗原表位位于E蛋白的第三结构域(DomainⅢ,D_Ⅲ)。将DTMUV E蛋白D_Ⅲ结构域... 为鉴定鸭坦布苏病毒(duck Tembusu virus,DTMUV)的B细胞抗原表位,以纯化的DTMUV YY5株为抗原制备了2株单克隆抗体AE4和BD10,研究证实BD10为线性化表位,其结合的抗原表位位于E蛋白的第三结构域(DomainⅢ,D_Ⅲ)。将DTMUV E蛋白D_Ⅲ结构域基因截短为具有末端相互重叠的15段,与MBP融合表达后以单克隆抗体BD10进行肽库扫描,结果筛选出DTMUV一个B细胞线性表位_(385)LVGSGKGQI_(393)(EP385)。该表位原核融合表达产物免疫小鼠制备的抗体,能够和DTMUV E蛋白反应,表明EP385表位具有良好的免疫原性,可为DTMUV多肽疫苗的研制及特异血清学诊断方法的开发奠定基础。 展开更多

关键词 鸭坦布苏病毒 单克隆抗体 肽库扫描 抗原表位

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新型鸭呼肠孤病毒一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测方法的建立与应用 被引量：5

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作者 云涛 华炯钢 +3 位作者 叶伟成 倪征 陈柳 张存 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2020年第4期571-576,共6页

为建立一种快速、敏感和特异性检测新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)的方法,本研究根据GenBank数据库中NDRV S3基因保守序列设计1对特异性引物和1条MGB荧光探针,建立了一种检测NDRV的一步法MGB荧光定量RT-PCR方法,对其特异... 为建立一种快速、敏感和特异性检测新型鸭呼肠孤病毒(novel duck reovirus,NDRV)的方法,本研究根据GenBank数据库中NDRV S3基因保守序列设计1对特异性引物和1条MGB荧光探针,建立了一种检测NDRV的一步法MGB荧光定量RT-PCR方法,对其特异性、敏感性和重复性进行检验,并与普通RT-PCR进行比较。结果显示,扩增标准曲线相关系数为0.999,扩增产物的熔解曲线仅出现单特异峰。该方法对经典鸭呼肠孤病毒、H9N2禽流感病毒、鸭坦布苏病毒、A型鸭肝炎病毒、鸭新城疫病毒、鸭瘟病毒及番鸭细小病毒均未检测到信号,对NDRV的最小检出量为10拷贝·μL^-1。组内和组间变异系数均小于2%,重复性好。此外,利用该方法对239份疑似新型呼肠孤病毒病样品进行检测,常规RT-PCR检测时有75份为阳性,一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法检测时有100份为阳性,而且常规RT-PCR检测出的阳性样品用一步法TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR检测时均为阳性,符合率为100%。该检测方法的建立为NDRV早期快速检测及定量分析提供新的方法。 展开更多

关键词 新型鸭呼肠孤病毒 MGB探针 荧光定量RT-PCR 检测方法

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表达鸭坦布苏病毒E蛋白的重组鸭瘟病毒的构建及其生物学特性 被引量：4

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作者 陈柳 余斌 +4 位作者 倪征 华炯钢 叶伟成 云涛 张存 《浙江农业学报》 CSCD 北大核心 2015年第11期1889-1895,共7页

为开展鸭瘟病毒-鸭坦布苏病毒二联苗的研究,将密码子优化的鸭坦布苏病毒(DTMUV)E基因插入转移载体p EP-BGH-end构建了p EP-BGH-E重组表达质粒。在鸭瘟病毒疫苗株细菌人工染色体(p DEVvac)的基础上,首先通过Red E/T两步重组法构建了EF1... 为开展鸭瘟病毒-鸭坦布苏病毒二联苗的研究,将密码子优化的鸭坦布苏病毒(DTMUV)E基因插入转移载体p EP-BGH-end构建了p EP-BGH-E重组表达质粒。在鸭瘟病毒疫苗株细菌人工染色体(p DEVvac)的基础上,首先通过Red E/T两步重组法构建了EF1启动子替换GFP基因CMV启动子的p DEV-EF1突变体克隆,并将p EP-BGH-E质粒上的重组表达框p CMV-E-BGH-p A再次通过两步重组克隆至p DEV-EF1突变体的US7和US8基因之间,构建了携带有外源基因DTMUV E的突变体克隆p DEV-E。用磷酸钙法转染鸡胚成纤维细胞(CEFs)获得了重组病毒r DEV-E。病毒蚀斑大小测定结果显示,r DEV-E在CEFs上的蚀斑面积较亲本株相比稍有减少。Western blotting分析表明,外源蛋白E在病毒感染的CEFs细胞中成功表达。 展开更多

关键词 鸭瘟病毒 鸭坦布苏病毒 E蛋白 细菌人工染色体 重组病毒

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