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大肠杆菌外膜蛋白F的原核表达、多克隆抗体制备及生物信息学分析 被引量：11
1
作者 伍娜娜 康超 +5 位作者 荣娜 刘祥 陈春琳 陈琛 丁锐 吴三桥 《河南农业科学》 北大核心 2019年第3期145-152,共8页
为获得大肠杆菌外膜蛋白OmpF并对其耐药性功能进行研究,通过分子克隆技术构建OmpF蛋白重组表达菌株,利用正交试验法获得OmpF菌株的最佳培养条件和表达条件,采用SDS-PAGE电泳切胶纯化方法获得OmpF蛋白,免疫小鼠获得OmpF蛋白多克隆抗体,We... 为获得大肠杆菌外膜蛋白OmpF并对其耐药性功能进行研究,通过分子克隆技术构建OmpF蛋白重组表达菌株,利用正交试验法获得OmpF菌株的最佳培养条件和表达条件,采用SDS-PAGE电泳切胶纯化方法获得OmpF蛋白,免疫小鼠获得OmpF蛋白多克隆抗体,Western blotting方法检测多克隆抗体的特异性,使用DNAMAN 8.0与MEGA 5.0软件对OmpF蛋白进行同源性和系统发生分析。结果显示,PCR扩增获得1 089 bp的ompF基因,成功构建pET-32a-ompF载体,其诱导表达产物分子质量为38 ku,与预期大小一致。正交试验获得OmpF菌株的最佳培养条件为葡萄糖浓度为0,转速为230 r/min,装液量为50 mL;最佳表达条件为诱导时菌液OD_(600)为0.5,IPTG终浓度为0.1 mmol/L,诱导时间为8 h,温度为28℃。SDS-PAGE切胶纯化获得高纯度的OmpF蛋白后,利用Western blotting证实OmpF蛋白抗血清具有较好的特异性。OmpF蛋白序列系统发生分析发现,OmpF蛋白在不同种类的细菌中具有较高的同源性,OmpF蛋白产生的抗体可能为不同种细菌的感染提供交叉免疫保护作用,并且不同种类细菌中OmpF蛋白可能具有相似的分子功能。 展开更多
关键词 大肠杆菌 外膜蛋白OmpF 原核表达 正交试验 诱导条件 生物信息学分析
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溶藻弧菌TolB蛋白的生物信息学分析 被引量：8
2
作者 伍娜娜 康超 +5 位作者 荣娜 刘祥 陈春琳 陈琛 丁锐 吴三桥 《河南农业科学》 CSCD 北大核心 2018年第11期134-141,共8页
对溶藻弧菌转运蛋白(TolB)进行结构和功能进行分析,设计其表位多肽重组疫苗,以提高溶藻弧菌TolB蛋白的免疫效果,运用生物信息学方法对溶藻弧菌TolB蛋白的系统进化关系、理化性质、高级结构和细胞抗原表位进行分析。进化关系结果显示,溶... 对溶藻弧菌转运蛋白(TolB)进行结构和功能进行分析,设计其表位多肽重组疫苗,以提高溶藻弧菌TolB蛋白的免疫效果,运用生物信息学方法对溶藻弧菌TolB蛋白的系统进化关系、理化性质、高级结构和细胞抗原表位进行分析。进化关系结果显示,溶藻弧菌的TolB蛋白与副溶血性弧菌、霍乱弧菌和费氏弧菌的TolB蛋白具有较高同源性,溶藻弧菌TolB蛋白可能对这4种菌株的感染起到交叉免疫保护作用。溶藻弧菌TolB蛋白为亲水性蛋白,1—22位氨基酸为其信号肽位置,无跨膜结构并定位于细胞膜外;溶藻弧菌TolB蛋白二级结构中以无规则卷曲(40.00%)、α-螺旋(18.67%)和β-转角(11.33%)为主。溶藻弧菌TolB蛋白可能存在4个优势B细胞抗原表位,1个细胞毒性T淋巴细胞(CTL)抗原表位,1个辅助T细胞(Th)抗原表位,并重组拼接获得抗原性较好的TolB蛋白表位多肽。 展开更多
关键词 溶藻弧菌 TolB蛋白 表位疫苗 抗原分析 生物信息学分析
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大肠杆菌免疫蛋白OmpA生物信息学分析及表位多肽疫苗设计 被引量：5
3
作者 伍娜娜 荣娜 +5 位作者 康超 刘祥 陈琛 陈春琳 丁锐 吴三桥 《河南农业科学》 北大核心 2019年第6期131-138,共8页
为进一步提高大肠杆菌外膜蛋白(OmpA)的免疫效果,对大肠杆菌的OmpA进行生物信息学分析并设计其表位多肽重组疫苗。运用DNAMAN 8.0和MEGA 5.0分别对OmpA进行同源性及系统发生分析,通过ExPASy-ProtParam对OmpA的理化性质进行分析,分别采用... 为进一步提高大肠杆菌外膜蛋白(OmpA)的免疫效果,对大肠杆菌的OmpA进行生物信息学分析并设计其表位多肽重组疫苗。运用DNAMAN 8.0和MEGA 5.0分别对OmpA进行同源性及系统发生分析,通过ExPASy-ProtParam对OmpA的理化性质进行分析,分别采用Signal P 4.1与TMHMM Serverv.2.0对OmpA进行信号肽和跨膜结构预测,应用SOPMA和SWISS-MODEL对OmpA进行二级结构和三级结构预测,通过String进行蛋白质互作网络分析,使用BepiPred 1.0和ABCpred方法预测OmpA的B细胞抗原表位,利用神经网络法与MHC-Ⅱ类分子结合肽在线预测程序预测OmpA的CTL和Th细胞抗原表位,采用DNASTAR.Lasergene.v 7.1拼接获得优势抗原表位。进化关系结果显示,OmpA在肠道菌属间遗传进化关系较近,OmpA抗体可能为不同种肠道细菌的感染提供交叉免疫保护。OmpA为亲水性蛋白质,第1—21位氨基酸为信号肽位置,具跨膜结构。OmpA的二级结构中以无规则卷曲(45.66%)、α-螺旋(31.79%)、β-片层(16.18%)和β-转角(6.36%)为主,其三级结构为桶状结构。OmpA与par、coa蛋白之间存在互作。OmpA可能有4个B细胞抗原表位,1个CTL细胞抗原表位,1个Th细胞抗原表位,且重组获得抗原性较好的OmpA表位多肽。 展开更多
关键词 大肠杆菌 OMPA 表位多肽疫苗 生物信息学分析
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重组铜绿假单胞菌外膜蛋白D的原核表达与多克隆抗体制备研究 被引量：2
4
作者 伍娜娜 荣娜 +5 位作者 康超 刘祥 陈琛 陈春琳 马心怡 吴三桥 《河北农业大学学报》 CAS CSCD 北大核心 2019年第1期99-105,共7页
为获得铜绿假单胞菌外膜蛋白OprD并研究其分子功能。本研究采用分子克隆构建OprD蛋白重组表达菌株,用正交试验设计方法获得OprD菌株的最优表达条件和培养条件,通过SDS-PAGE切胶的方法纯化OprD蛋白,小鼠免疫制备OprD多克隆抗血清,蛋白质... 为获得铜绿假单胞菌外膜蛋白OprD并研究其分子功能。本研究采用分子克隆构建OprD蛋白重组表达菌株,用正交试验设计方法获得OprD菌株的最优表达条件和培养条件,通过SDS-PAGE切胶的方法纯化OprD蛋白,小鼠免疫制备OprD多克隆抗血清,蛋白质印迹法检测抗血清的特异性。使用DNAMan和MEGA软件对OprD蛋白进行同源性和系统发生分析。结果表明,OprD重组载体双酶切、DNA测序鉴定结果、OprD蛋白表达与纯化条带大小分别与预测相符。正交试验获得OprD菌株的最优培养条件为:葡萄糖浓度为0,转速230r/min,装液量为50mL;最优表达条件为:菌液OD600=0.8时加入终浓度为0.3mmol/L的异丙基β-D-1-硫代吡喃半乳糖苷(IPTG),37℃诱导12h。SDS-PAGE电泳切胶纯化获得纯度较高的OprD蛋白。蛋白质印迹法证实OprD蛋白抗血清具有较好的特异性。OprD蛋白序列系统发生分析发现,同菌属细菌存在较高的同源性,并且亲缘关系较近的细菌中OprD蛋白可能具有相似的分子功能。 展开更多
关键词 铜绿假单胞菌 外膜蛋白OprD 多克隆抗体 诱导条件
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鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白P5的原核表达、免疫保护及抗血浆杀菌作用研究 被引量：6
5
作者 荣娜 简思杰 +3 位作者 孙薇 康超 伍娜娜 刘祥 《西北农业学报》 CAS CSCD 北大核心 2021年第3期333-342,共10页
研究鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白P5的免疫学功能,为相关疫苗开发奠定理论基础。采用生物信息学方法分析P5的理化性质;分子克隆构建P5表达菌株并确定其最佳诱导表达条件,包涵体洗涤和SDS-PAGE电泳切胶纯化P5蛋白,并免疫小鼠制备P5抗血... 研究鱼类致病嗜水气单胞菌外膜蛋白P5的免疫学功能,为相关疫苗开发奠定理论基础。采用生物信息学方法分析P5的理化性质;分子克隆构建P5表达菌株并确定其最佳诱导表达条件,包涵体洗涤和SDS-PAGE电泳切胶纯化P5蛋白,并免疫小鼠制备P5抗血清;Western blotting检测抗血清特异性与效价,免疫酶联法模拟P5抗血清对嗜水气单胞菌的体外识别;P5抗血清被动免疫红鲫,攻毒以评价P5蛋白的免疫保护功能;Western blotting分析P5蛋白抵抗鱼血浆的杀菌作用。结果表明:P5蛋白在气单胞菌属间同源性较好,进化保守。成功克隆表达、纯化P5蛋白,其最佳表达条件为:诱导时菌液浓度OD_(600)=1.0,IPTG浓度0.5 mmol/L,32℃诱导8 h。Western blotting验证P5抗血清特异性较好,效价达到1∶1600,ELISA显示P5抗血清与嗜水气单胞菌存在识别作用,表明P5蛋白具有较好的免疫原性与抗原性。被动免疫显示P5抗血清对红鲫的免疫保护率为显著性的56%,具有良好的免疫保护作用。Western blotting发现P5蛋白可通过表达下调有效抵抗鱼血浆的杀菌作用,表明其可能与细菌抗血浆杀菌有关。综上,嗜水气单胞菌外膜蛋白P5是一种保护性抗原,有望作为防治嗜水气单胞菌感染的疫苗候选成分。 展开更多
关键词 嗜水气单胞菌 外膜蛋白P5 多克隆抗血清 血浆杀菌作用 被动免疫
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不同激素对西洋参胚性愈伤组织诱导的影响
6
作者 蒋超 蒋景龙 +4 位作者 沈季雪 伍娜娜 张庆 徐卫平 田雲 《安徽农业科学》 CAS 2015年第35期234-237,共4页
[目的]建立高效的西洋参胚性愈伤组织诱导体系。[方法]以裂口的西洋参种子为试材,研究不同激素对西洋参种胚脱分化启动与愈伤组织诱导的影响,并分析其体胚发生过程。[结果]不同激素对西洋参胚性愈伤组织诱导效果存在明显差异,当培养条件... [目的]建立高效的西洋参胚性愈伤组织诱导体系。[方法]以裂口的西洋参种子为试材,研究不同激素对西洋参种胚脱分化启动与愈伤组织诱导的影响,并分析其体胚发生过程。[结果]不同激素对西洋参胚性愈伤组织诱导效果存在明显差异,当培养条件为MS+2,4-D 0.5 mg/L+6-BA 1.0 mg/L+NAA 1.0 mg/L+IBA 0.5 mg/L时,愈伤组织诱导率最高为96.4%;在解剖显微镜下观察,西洋参体胚发生过程中球形胚、心形胚、鱼雷形胚和子叶形胚清晰可见。[结论]该研究为西洋参快繁体系的建立和优化奠定一定的理论基础。 展开更多
关键词 西洋参 愈伤组织 培养条件 体细胞胚
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嗜水气单胞菌外膜蛋白OmpK的原核表达、抗原性分析及抗血浆杀菌作用研究 被引量：3
7
作者 荣娜 康超 +3 位作者 孙薇 简思杰 伍娜娜 刘祥 《西南农业学报》 CSCD 北大核心 2021年第6期1359-1366,共8页
【目的】本文研究了淡水养殖主要病原菌嗜水气单胞菌外膜蛋白OmpK的免疫学功能,为相关疫苗开发奠定理论基础。【方法】采用生物信息学分析OmpK蛋白的理化性质、结构与功能;利用分子克隆构建OmpK蛋白表达菌株,结合L_(9)^(3~4)正交实验确... 【目的】本文研究了淡水养殖主要病原菌嗜水气单胞菌外膜蛋白OmpK的免疫学功能,为相关疫苗开发奠定理论基础。【方法】采用生物信息学分析OmpK蛋白的理化性质、结构与功能;利用分子克隆构建OmpK蛋白表达菌株,结合L_(9)^(3~4)正交实验确定其最佳诱导表达条件,通过包涵体洗涤和SDS-PAGE电泳切胶纯化OmpK蛋白;Western blot检测抗血清特异性与效价,ELISA检测OmpK蛋白抗血清对嗜水气单胞菌的体外识别;Western blot分析OmpK蛋白抵抗鱼血浆的杀菌作用。【结果】OmpK为亲水性蛋白,二级结构以无规则卷曲为主,三级结构呈桶状,在气单胞菌属间同源性较高,进化相对保守;成功构建OmpK表达菌株,并获得较高纯度的OmpK蛋白,其最佳表达条件为:诱导时菌液浓度OD_(600)=1.0,IPTG浓度为0.5 mmol/L,28℃诱导8 h;Western blot验证OmpK蛋白抗血清特异性较好,且效价达到1∶1600,ELISA显示OmpK蛋白抗血清与嗜水气单胞菌存在体外相互作用;Western blot发现OmpK蛋白可通过表达下调实现抵抗鱼血浆的杀菌作用。【结论】原核表达的OmpK蛋白,可刺激机体产生特异性抗体,与嗜水气单胞菌存在体外相互作用。此外,OmpK蛋白可有效抵抗鱼血浆对嗜水气单胞菌的杀菌作用。本研究为嗜水气单胞菌OmpK蛋白的免疫作用研究与疫苗的开发奠定基础。 展开更多
关键词 嗜水气单胞菌 外膜蛋白OmpK 多克隆抗血清 抗原性 血浆杀菌作用
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