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单增李斯特菌PTS系统转运蛋白IIB^(man)介导运动性和感染的功能研究
被引量：
2
1
作者
张佳雪
陈绵绵
+7 位作者
程丽丽
任耿佳
徐像文
鲁珂蓥
庄楠茜
孙静
宋厚辉
程昌勇
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第11期1179-1187,共9页
为探究单增李斯特菌(LM)磷酸转移酶系统(PTS)转运蛋白IIB^(man)在LM生长、运动性及其生物学功能,本研究以LM EGD-e株基因组为模板,经PCR扩增iiB^(man)基因的上下游基因片段(不包含iiB^(man)基因),插入质粒pKSV7以构建缺失质粒;以LM EGD-...
为探究单增李斯特菌(LM)磷酸转移酶系统(PTS)转运蛋白IIB^(man)在LM生长、运动性及其生物学功能,本研究以LM EGD-e株基因组为模板,经PCR扩增iiB^(man)基因的上下游基因片段(不包含iiB^(man)基因),插入质粒pKSV7以构建缺失质粒;以LM EGD-e基因组为模板,采用PCR扩增iiB^(man)基因与启动子片段,插入质粒pIMK2以构建回补质粒,经PCR和测序鉴定后,将缺失质粒转化LM EGD-e感受态细胞,通过氯霉素抗性及42℃压力下使重组质粒与LM EGD-e株的同源片段发生同源重组单交换获得一代同源重组菌株,然后在无抗性培养基中30℃培养使质粒丢失,获得缺失株ΔiiB^(man)。将回补质粒转化ΔiiB^(man)感受态细胞中,通过卡那霉素抗性筛选获得回补株CΔiiB^(man),缺失株和回补株均经PCR和测序鉴定。37℃培养EGD-e、ΔiiB^(man)、CΔiiB^(man)12 h,期间每隔1 h测定OD_(600nm)并绘制生长曲线,分析各菌株生长特性,结果显示,各菌株体外生长趋势相似。将各菌株菌液接种于TSA半固体培养基,培养至24 h和48 h时检测细菌运动圈大小,结果显示ΔiiB^(man)的运动圈直径分别是EGD-e的1.5及1.6倍(P<0.05、P<0.01),CΔiiB^(man)与EGD-e运动圈直径均基本一致。在各菌株培养上清中加入绵羊血,检测各菌株溶血能力,结果显示,ΔiiB^(man)的溶血能力较EGD-e及CΔiiB^(man)增强。将各菌株以MOI 20感染RAW264.7细胞,在感染后2 h、5 h和8 h收集细胞进行点样计数,结果显示,在感染后2 h和5 h时ΔiiB^(man)的胞内增殖能力较EGD-e及CΔiiB^(man)显著增强(P<0.05)。将各菌株以2×10^(5)cfu/只经腹腔注射感染小鼠48 h后剖杀,取肝脏和脾脏研磨并点样计数,结果显示,ΔiiB^(man)在小鼠脏器载菌量较EGD-e及CΔiiB^(man)极显著增多(P<0.001)。上述结果首次表明IIB^(man)不影响LM的生长,但影响LM的运动性及提高LM的体外溶血活性;IIB^(man)参与LM的胞内增殖和宿主脏器定植。本研究为了解LM PTS系统所介导的细菌体外环境适应及宿主感染的分子机制,以及LM感染的防控奠定了基础。
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关键词
单增李斯特菌
磷酸转移酶系统
IIB^(man)转运蛋白
运动性
感染
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职称材料
信息素脂蛋白PplA对单核细胞增生性李斯特菌运动性和生物被膜形成调控的研究
2
作者
杜小栩
陈绵绵
+5 位作者
任耿佳
杨立锋
丁强
宋厚辉
江玲丽
孙静
《中国预防兽医学报》
2025年第7期667-675,共9页
为研究单核细胞增生性李斯特菌(LM)脂蛋白PplA在细菌运动、鞭毛形成和生物被膜(BF)形成中的调控作用,本研究从LM野生株EGD-e中扩增pplA基因的上下游片段分别克隆至pKSV7载体中构建pplA基因缺失重组质粒并采用PCR与测序鉴定;以EGD-e为模...
为研究单核细胞增生性李斯特菌(LM)脂蛋白PplA在细菌运动、鞭毛形成和生物被膜(BF)形成中的调控作用,本研究从LM野生株EGD-e中扩增pplA基因的上下游片段分别克隆至pKSV7载体中构建pplA基因缺失重组质粒并采用PCR与测序鉴定;以EGD-e为模板扩增pplA基因及其启动子片段,分别克隆至pIMK2质粒中构建pplA基因回补质粒并经PCR与测序鉴定。将缺失重组质粒转化EGD-e感受态细胞并利用双重压力(42℃、氯霉素抗性)使重组质粒中的同源臂序列与LM基因组发生交换,获得携带缺失重组质粒的pplA基因缺失菌株后,在30℃无抗环境下传代培养使缺失重组质粒丢失,以获得缺失株(ΔpplA)并经PCR与测序鉴定;将回补质粒转化ΔpplA感受态细胞,利用卡那霉素抗性培养基筛选得到回补株(CΔpplA)并经PCR与测序鉴定。在37℃和30℃分别培养各菌株,每隔1 h测定各菌株菌液的OD_(600nm)值,共测12 h以绘制各菌株的生长曲线,同时对各菌株点板计数,结果显示,PplA不影响LM的体外生长能力。将各菌株菌液接种于TSA半固体培养基,培养至24 h和48 h时检测细菌运动圈大小,结果显示,与野生菌株和回补株相比,ΔpplA株运动圈直径极显著和显著增大(P<0.01、P<0.05)。采用RT-qPCR方法检测野生株与ΔpplA株中鞭毛相关基因(flgB、flgC、flgD、flgE、flgG、flgK、flgL、mogR、gmaR、flhA、flhB、flaA、fliD、fliE、fliF、fliG、fliH、fliI、fliM、fliP、fliQ、fliR、mot B)的转录水平。结果显示,与野生株相比,ΔpplA株鞭毛相关基因的转录水平显著提高,其中flhB、fliF、flgD和flgE基因转录水平的变化最显著。在4℃、25℃以及37℃条件下静置培养EGD-e、ΔpplA及CΔpplA株,通过结晶紫法中的酶标仪检测法和显微镜观察法分别检测BF的形成量和BF结构的变化。结果显示,在4℃和25℃条件下,ΔpplA株BF的形成量显著和极显著低于野生株和回补株(P<0.05、P<0.001),而在37℃时,ΔpplA株BF的形成量极显著高于野生株和回补株(P<0.01)。在4℃和25℃条件下,ΔpplA株的BF结构较野生株和回补株更为疏松,而在37℃条件下,ΔpplA株BF的结构较野生株和回补株最为紧密。以上结果表明,LM信息素脂蛋白PplA不影响细菌的体外生长能力,但可以通过调控鞭毛相关基因的转录水平抑制细菌的体外运动能力,并通过鞭毛的形成影响LMBF的形成能力。本研究为探究LM通过PplA调控鞭毛形成相关基因的表达以适应外界和宿主环境的分子机制提供数据参考。
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关键词
单核细胞增生性李斯特菌
信息素脂蛋白PplA
运动性
鞭毛基因转录
生物被膜形成
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职称材料
题名
单增李斯特菌PTS系统转运蛋白IIB^(man)介导运动性和感染的功能研究
被引量：
2
1
作者
张佳雪
陈绵绵
程丽丽
任耿佳
徐像文
鲁珂蓥
庄楠茜
孙静
宋厚辉
程昌勇
机构
浙江农林大学动物科技学院动物医学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/中澳动物健康大数据分析联合实验室
台州市椒江区农业农村和水利局
出处
《中国预防兽医学报》
CAS
CSCD
北大核心
2023年第11期1179-1187,共9页
基金
浙江省自然科学基金(LQ20C180001、LY23C180002)
国家自然科学基金(32002253、31972648、31872620)
+1 种基金
浙江农林大学创新训练项目(S202210341103)
浙江省大学生科技创新活动计划暨新苗人才计划(2023R412020)。
文摘
为探究单增李斯特菌(LM)磷酸转移酶系统(PTS)转运蛋白IIB^(man)在LM生长、运动性及其生物学功能,本研究以LM EGD-e株基因组为模板,经PCR扩增iiB^(man)基因的上下游基因片段(不包含iiB^(man)基因),插入质粒pKSV7以构建缺失质粒;以LM EGD-e基因组为模板,采用PCR扩增iiB^(man)基因与启动子片段,插入质粒pIMK2以构建回补质粒,经PCR和测序鉴定后,将缺失质粒转化LM EGD-e感受态细胞,通过氯霉素抗性及42℃压力下使重组质粒与LM EGD-e株的同源片段发生同源重组单交换获得一代同源重组菌株,然后在无抗性培养基中30℃培养使质粒丢失,获得缺失株ΔiiB^(man)。将回补质粒转化ΔiiB^(man)感受态细胞中,通过卡那霉素抗性筛选获得回补株CΔiiB^(man),缺失株和回补株均经PCR和测序鉴定。37℃培养EGD-e、ΔiiB^(man)、CΔiiB^(man)12 h,期间每隔1 h测定OD_(600nm)并绘制生长曲线,分析各菌株生长特性,结果显示,各菌株体外生长趋势相似。将各菌株菌液接种于TSA半固体培养基,培养至24 h和48 h时检测细菌运动圈大小,结果显示ΔiiB^(man)的运动圈直径分别是EGD-e的1.5及1.6倍(P<0.05、P<0.01),CΔiiB^(man)与EGD-e运动圈直径均基本一致。在各菌株培养上清中加入绵羊血,检测各菌株溶血能力,结果显示,ΔiiB^(man)的溶血能力较EGD-e及CΔiiB^(man)增强。将各菌株以MOI 20感染RAW264.7细胞,在感染后2 h、5 h和8 h收集细胞进行点样计数,结果显示,在感染后2 h和5 h时ΔiiB^(man)的胞内增殖能力较EGD-e及CΔiiB^(man)显著增强(P<0.05)。将各菌株以2×10^(5)cfu/只经腹腔注射感染小鼠48 h后剖杀,取肝脏和脾脏研磨并点样计数,结果显示,ΔiiB^(man)在小鼠脏器载菌量较EGD-e及CΔiiB^(man)极显著增多(P<0.001)。上述结果首次表明IIB^(man)不影响LM的生长,但影响LM的运动性及提高LM的体外溶血活性;IIB^(man)参与LM的胞内增殖和宿主脏器定植。本研究为了解LM PTS系统所介导的细菌体外环境适应及宿主感染的分子机制,以及LM感染的防控奠定了基础。
关键词
单增李斯特菌
磷酸转移酶系统
IIB^(man)转运蛋白
运动性
感染
Keywords
Listeria monocytogenes
phosphotransferase system(PTS)
iiB^(man) transporter protein
motility
infection
分类号
S852.61 [农业科学—基础兽医学]
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职称材料
题名
信息素脂蛋白PplA对单核细胞增生性李斯特菌运动性和生物被膜形成调控的研究
2
作者
杜小栩
陈绵绵
任耿佳
杨立锋
丁强
宋厚辉
江玲丽
孙静
机构
浙江农林大学动物医学院/浙江省畜禽绿色生态健康养殖应用技术研究重点实验室/动物健康互联网检测技术浙江省工程研究中心/浙江省动物医学与健康管理国际科技合作基地/同一健康和食品安全“一带一路”国际联合实验室/中澳动物健康大数据分析联合实验室
出处
《中国预防兽医学报》
2025年第7期667-675,共9页
基金
浙江省自然科学基金(LY23C180002、LY19C180001)
宁波市公益类科技项目(2022S006)
宁波市自然科学基金一般项目(2023J241)。
文摘
为研究单核细胞增生性李斯特菌(LM)脂蛋白PplA在细菌运动、鞭毛形成和生物被膜(BF)形成中的调控作用,本研究从LM野生株EGD-e中扩增pplA基因的上下游片段分别克隆至pKSV7载体中构建pplA基因缺失重组质粒并采用PCR与测序鉴定;以EGD-e为模板扩增pplA基因及其启动子片段,分别克隆至pIMK2质粒中构建pplA基因回补质粒并经PCR与测序鉴定。将缺失重组质粒转化EGD-e感受态细胞并利用双重压力(42℃、氯霉素抗性)使重组质粒中的同源臂序列与LM基因组发生交换,获得携带缺失重组质粒的pplA基因缺失菌株后,在30℃无抗环境下传代培养使缺失重组质粒丢失,以获得缺失株(ΔpplA)并经PCR与测序鉴定;将回补质粒转化ΔpplA感受态细胞,利用卡那霉素抗性培养基筛选得到回补株(CΔpplA)并经PCR与测序鉴定。在37℃和30℃分别培养各菌株,每隔1 h测定各菌株菌液的OD_(600nm)值,共测12 h以绘制各菌株的生长曲线,同时对各菌株点板计数,结果显示,PplA不影响LM的体外生长能力。将各菌株菌液接种于TSA半固体培养基,培养至24 h和48 h时检测细菌运动圈大小,结果显示,与野生菌株和回补株相比,ΔpplA株运动圈直径极显著和显著增大(P<0.01、P<0.05)。采用RT-qPCR方法检测野生株与ΔpplA株中鞭毛相关基因(flgB、flgC、flgD、flgE、flgG、flgK、flgL、mogR、gmaR、flhA、flhB、flaA、fliD、fliE、fliF、fliG、fliH、fliI、fliM、fliP、fliQ、fliR、mot B)的转录水平。结果显示,与野生株相比,ΔpplA株鞭毛相关基因的转录水平显著提高,其中flhB、fliF、flgD和flgE基因转录水平的变化最显著。在4℃、25℃以及37℃条件下静置培养EGD-e、ΔpplA及CΔpplA株,通过结晶紫法中的酶标仪检测法和显微镜观察法分别检测BF的形成量和BF结构的变化。结果显示,在4℃和25℃条件下,ΔpplA株BF的形成量显著和极显著低于野生株和回补株(P<0.05、P<0.001),而在37℃时,ΔpplA株BF的形成量极显著高于野生株和回补株(P<0.01)。在4℃和25℃条件下,ΔpplA株的BF结构较野生株和回补株更为疏松,而在37℃条件下,ΔpplA株BF的结构较野生株和回补株最为紧密。以上结果表明,LM信息素脂蛋白PplA不影响细菌的体外生长能力,但可以通过调控鞭毛相关基因的转录水平抑制细菌的体外运动能力,并通过鞭毛的形成影响LMBF的形成能力。本研究为探究LM通过PplA调控鞭毛形成相关基因的表达以适应外界和宿主环境的分子机制提供数据参考。
关键词
单核细胞增生性李斯特菌
信息素脂蛋白PplA
运动性
鞭毛基因转录
生物被膜形成
Keywords
Listeria monocytogenes
pheromone lipoprotein PplA
motility
flagellar gene transcription
biofilm formation
分类号
S852.61 [农业科学]
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题名
作者
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1
单增李斯特菌PTS系统转运蛋白IIB^(man)介导运动性和感染的功能研究
张佳雪
陈绵绵
程丽丽
任耿佳
徐像文
鲁珂蓥
庄楠茜
孙静
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