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逆转录病毒感染法对RP患者人体细胞向iPS细胞和iPS—RPE细胞诱导分化的研究 被引量：1
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作者 田媛媛 蒋超 +3 位作者 陈雪 丁思加 徐敏 赵晨 《中华实验眼科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2016年第9期793-798,共6页
背景视网膜色素上皮（RPE）细胞移植是目前人类尝试治疗视网膜色素变性（RP）的主要手段。诱导多能干细胞（iPSCs）将成为移植细胞的一个重要来源，人胚胎干细胞（hESCs）可以无限期地自我更新和分化，是RPE细胞移植的重要供体来源。此... 背景视网膜色素上皮（RPE）细胞移植是目前人类尝试治疗视网膜色素变性（RP）的主要手段。诱导多能干细胞（iPSCs）将成为移植细胞的一个重要来源，人胚胎干细胞（hESCs）可以无限期地自我更新和分化，是RPE细胞移植的重要供体来源。此外，iPS-RPE细胞为患者自身细胞成为治疗源组织提供了个性化治疗平台。目的评估利用逆转录病毒将Oct4、Sox2、c—Myc和K归4种基因导入RP患者皮肤成纤维细胞后诱导入iPSCs的可行性，并建立将正常人iPSCs诱导分化为RPE细胞的方法。方法分别采集基因突变点为SNRNP200p．S1087L的RP患者及无SNRNP200p．S1087L突变受试者的大腿皮肤组织块约2cm-3cm。采用胰蛋白酶消化和组织块培养法分离纯化得到成纤维细胞并进行传代，取第3代细胞用于研究，分别采用形态学和免疫荧光技术对培养细胞进行鉴定。采用含OCT4、SOX2、C—MYC和KLF44种cDNA的质粒病毒转染的成纤维细胞，并用hESCs条件培养液诱导iPSCs，采用细胞形态学、碱性磷酸酶（AP）染色、干细胞表面多潜能标志物表达对所得到的iPSCs和iPS—RPE细胞进行鉴定，并通过细胞在SCID小鼠的体内种植考察iPSCs的成瘤性。采用诱导分化拟胚体（EB）法将不含SNRNP200p．S1087L突变的iPSCs诱导分化为RPE细胞，分别采用免疫荧光技术和实时荧光定量PCR法检测细胞中特异性蛋白的表达。结果用皮肤组织块培养的成纤维细胞呈梭形和多角形，光学显微镜下可见细胞间排列紧密，细胞形态和大小趋于一致，细胞中特异性蛋白Vimentin表达阳性。经逆病毒转染的成纤维细胞培养后第5～7天可见小的细胞聚集，细胞形态由梭形变为圆形；培养后20d出现类似hESCs集落形态的iPSCs克隆；培养后25～30d细胞中的标志物SSEA3、SSEA4、TRA—1-60、TRA-1-81及Nanog均呈阳性表达，培养后12周形成的iPSCs克隆中AP染色阳性，接种到SCID小鼠体内后形成畸胎瘤。免疫荧光染色显示，诱导分化后30d时iPS—RPE细胞中RPE细胞特异性标志物RPE65、闭锁小带蛋白1（ZO-1）和卵磷脂视黄醇酰基转移酶（LRAT）蛋白均呈阳性表达。结论利用逆转录病毒将Oct4、Sox2、c-Myc和Kif44种基因转入SNRNP200p.S1087L突变的RP患者皮肤成纤维细胞后可以获得iPSCs，建立的iPSCs有ESCs的形态和多能分化的特征。采用同样的转染技术可在无SNRNP200p．S1087L突变的人皮肤成纤维细胞中建立体外高分化、高效能的iPS-RPE细胞。 展开更多
关键词 人皮肤成纤维细胞/细胞学 诱导多潜能干细胞/细胞学 视网膜色素上皮/细胞学 视网膜色素变性/治疗 细胞培养 细胞分化 生物标志物
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雷帕霉素对ARPE19细胞分化的调控作用
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作者 蒋超 赵晨 +1 位作者 石厚霞 丁思加 《中华实验眼科杂志》 CAS CSCD 北大核心 2015年第12期1064-1068,共5页
背景视网膜色素上皮（RPE）细胞移植是多种遗传性视网膜变性疾病治疗的研究方向，但体外培养的RPE细胞系都存在细胞的去分化问题，而研究表明哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路的异常激活会导致RPE细胞的去分化状态。因此抑制m... 背景视网膜色素上皮（RPE）细胞移植是多种遗传性视网膜变性疾病治疗的研究方向，但体外培养的RPE细胞系都存在细胞的去分化问题，而研究表明哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白（mTOR）信号通路的异常激活会导致RPE细胞的去分化状态。因此抑制mTOR信号通路应有助于抑制RPE细胞的去分化状态。目的观察雷帕霉素是否能够抑制mTOR信号通路，调控人RPE细胞系ARPE19细胞的分化。方法将ARPE19细胞接种于12孔板进行培养并分为对照组和雷帕霉素组，分别在培养基中添加DMSO和终浓度400nmol／L的雷帕霉素，分别于细胞培养后24h和48h收集各组细胞，通过免疫荧光法检测各组细胞中闭锁小带1（ZO-1）蛋白的表达，分别采用实时荧光定量PCR和Western blot法检测各组细胞中RPE特异性基因和蛋白的相对表达量。结果免疫荧光检测结果显示，雷帕霉素组细胞培养后24h和48h，细胞中ZO-1表达的荧光强度均明显增强。实时荧光定量PCR结果显示，雷帕霉素组ARPE19细胞处理后24h，RPE细胞特异性基因RPE65、MERKT和LRAT mRNA相对表达量较对照组分别提高了25．97％、29．71％和13．00％，差异均有统计学意义（P=0．04、0．04、0．04）；雷帕霉素组细胞处理后48h，RPE65、LRAT、rLBP1、BEST1、keratin18和MERKT mRNA的相对表达量较对照组分别提高了174．00％、88．00％、56．18％、193．81％、10．83％和35．02％，差异均有统计学意义（P=0．00、0．04、0．U1、0．04、0．04、0．03）。Western blot检测结果显示，雷帕霉素组细胞处理后24h和48h，细胞中Akt／mTOR信号通路相关蛋白p-mTOR、p-P70S6和p—S6表达条带均较对照组均明显减弱；雷帕霉素处理细胞后24h，细胞中RPE特异性蛋白ZO-1蛋白的相对表达量提高40％，差异有统计学意义（P=0．01）；雷帕霉素处理细胞后48h，ZO-1、MERKT、Catenin和LRAT蛋白的相对表达量较对照组分别提高36．00％、57．37％、13．68％和41．07％，差异均有统计学意义（P=0．Ol、0．00、0．04、0．04）。结论雷帕霉素可以抑制mTOR信号转导通路的激活，上调ARPE19细胞中RPE特异性基因的表达；抑制mTOR信号转导通路后体外培养的RPE细胞系更接近于活体RPE细胞。 展开更多
关键词 ARPE19细胞 雷帕霉素 哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白信号通路 分化
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