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ANG-1基因重组腺相关病毒获取及转染猪骨髓干细胞的研究
被引量：
2
1
作者
朱成楚
陈仕林
+2 位作者
刘玉清
唐礼江
包卫光
《浙江大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2009年第4期370-376,共7页
目的:构建携带血管形成素-1(ANG-1)基因腺相关病毒(AAV)载体,通过病毒包装和纯化及滴定,获得高纯度高感染性的病毒液,并转染到乳猪骨髓干细胞中,获得有效表达,为进行血管再生的基因治疗研究奠定基础。方法:利用PCR技术,获取目的基因ANG...
目的:构建携带血管形成素-1(ANG-1)基因腺相关病毒(AAV)载体,通过病毒包装和纯化及滴定,获得高纯度高感染性的病毒液,并转染到乳猪骨髓干细胞中,获得有效表达,为进行血管再生的基因治疗研究奠定基础。方法:利用PCR技术,获取目的基因ANG-1,通过重组DNA技术得到ANG-1与pUC119的重组质粒,采用Sal和Bgl双酶将pUC119中的目的基因ANG-1基因片断切出,再克隆到质粒pSNAV2.0中。用Lipofectamine将pSNAV ANG-1质粒转染293细胞后,用G418选择培养获得293/AAV2ANG-1细胞株,产生了有传染性的病毒颗粒,纯化并进行病毒DNA颗粒滴度测定。分别将绿色荧光蛋白(GFP)基因重组腺相关病毒(rAAV2GFP)及rAAV2ANG-1感染猪骨髓干细胞,并对转染效率及转染后表达情况进行初步研究。结果:测序证实ANG-1与GenBank提供的原始序列完全一致。重组载体经酶切鉴定与PCR筛选证实重组质粒和预期结果完全一致,在新的重组质粒中,ANG-1有一套CMV启动子和PolyA终止子系统。293细胞包装病毒效果良好,携带ANG-1的感染性AAV滴度为9×1011v.g/ml,用Western杂交法检测显示猪骨髓干细胞中表达ANG-1。1×106v.g/ml rAAV2GFP感染CD34阳性细胞48h后55%左右的细胞有明显的荧光。结论:ANG-1基因AAV构建成功,并能在骨髓干细胞中有效表达,为严重缺血性疾病基因治疗的研究奠定了基础。
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关键词
血管生成素1
/代谢
腺病毒科/遗传学
骨髓祖代细胞/代谢
重组
遗传
转染
腺相关病毒载体
骨髓
干
细胞
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职称材料
题名
ANG-1基因重组腺相关病毒获取及转染猪骨髓干细胞的研究
被引量：
2
1
作者
朱成楚
陈仕林
刘玉清
唐礼江
包卫光
机构
浙江省台州医院心胸外科
江苏省肿瘤医院胸外科
阜外医院临床心血管药理中心
出处
《浙江大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2009年第4期370-376,共7页
基金
国家人事部博士后基金资助课题(2002032188)
浙江省卫生厅重点资助项目(2005ZD012)
文摘
目的:构建携带血管形成素-1(ANG-1)基因腺相关病毒(AAV)载体,通过病毒包装和纯化及滴定,获得高纯度高感染性的病毒液,并转染到乳猪骨髓干细胞中,获得有效表达,为进行血管再生的基因治疗研究奠定基础。方法:利用PCR技术,获取目的基因ANG-1,通过重组DNA技术得到ANG-1与pUC119的重组质粒,采用Sal和Bgl双酶将pUC119中的目的基因ANG-1基因片断切出,再克隆到质粒pSNAV2.0中。用Lipofectamine将pSNAV ANG-1质粒转染293细胞后,用G418选择培养获得293/AAV2ANG-1细胞株,产生了有传染性的病毒颗粒,纯化并进行病毒DNA颗粒滴度测定。分别将绿色荧光蛋白(GFP)基因重组腺相关病毒(rAAV2GFP)及rAAV2ANG-1感染猪骨髓干细胞,并对转染效率及转染后表达情况进行初步研究。结果:测序证实ANG-1与GenBank提供的原始序列完全一致。重组载体经酶切鉴定与PCR筛选证实重组质粒和预期结果完全一致,在新的重组质粒中,ANG-1有一套CMV启动子和PolyA终止子系统。293细胞包装病毒效果良好,携带ANG-1的感染性AAV滴度为9×1011v.g/ml,用Western杂交法检测显示猪骨髓干细胞中表达ANG-1。1×106v.g/ml rAAV2GFP感染CD34阳性细胞48h后55%左右的细胞有明显的荧光。结论:ANG-1基因AAV构建成功,并能在骨髓干细胞中有效表达,为严重缺血性疾病基因治疗的研究奠定了基础。
关键词
血管生成素1
/代谢
腺病毒科/遗传学
骨髓祖代细胞/代谢
重组
遗传
转染
腺相关病毒载体
骨髓
干
细胞
Keywords
Angiopoietin-1/metab
Adenoviridae/genet
Myeloid progenitor cells/metabRecombination,genetic
Transfection
rAAV
Mesenchymal stem cells
分类号
R346 [医药卫生—基础医学]
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题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
ANG-1基因重组腺相关病毒获取及转染猪骨髓干细胞的研究
朱成楚
陈仕林
刘玉清
唐礼江
包卫光
《浙江大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2009
2
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