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复制缺陷的重组腺病毒介导的血管形成素-1基因的制备及其体外表达的研究
1
作者
陈仕林
梅举
+5 位作者
程茅薇
徐志云
张宝仁
黄盛东
景华
张石江
《医学研究生学报》
CAS
2001年第6期471-473,477,共4页
目的 :探讨重组腺病毒载体构建及其在体外的有效转录。 方法 :以RT PCR自人脾组织中克隆和筛选出血管形成素 1(Ang 1)全长cDNA ,测序鉴定正确后 ,经salI酶切并克隆到E1、E3 缺失的Ad5腺病毒载体 (PAxCAwt)中 ,应用cosmid TPC磷酸钙共...
目的 :探讨重组腺病毒载体构建及其在体外的有效转录。 方法 :以RT PCR自人脾组织中克隆和筛选出血管形成素 1(Ang 1)全长cDNA ,测序鉴定正确后 ,经salI酶切并克隆到E1、E3 缺失的Ad5腺病毒载体 (PAxCAwt)中 ,应用cosmid TPC磷酸钙共沉淀法 ,将含有左向转录表达单元重组载体PAxCAwtAng 1与DNA 末端肽复合物(TPC)一同转染 2 93细胞中 ,经挑选克隆、病毒扩增、纯化、浓度滴度测定 ,制备了纯化病毒颗粒 ,以此转染人脐静脉上皮细胞 (ECV30 4) ,收集转染后 17天的细胞 ,用RT PCR检测转染细胞中外源性Ang 1基因转录。 结果 :实验所克隆的Ang 1DNA片段为含有信号肽结构的长度为 15 15bp的全长cDNA ,与文献报道一致。外源基因在转染细胞中能有效转录。 结论 :Ad5 PAxCAwt转导的血管形成素
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关键词
血管形成素-1
腺病毒
基因转染
制备
体外表达
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职称材料
rAAV_2VEGF_(165)与rAAV_2ANG-1联合转染促猪缺血心肌血管生成的研究
被引量：
3
2
作者
朱成楚
陈仕林
+8 位作者
刘玉清
唐礼江
林仙方
包卫光
马德华
朱广球
周文娟
周仪林
杜丛文
《浙江大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2010年第6期610-617,共8页
目的:探讨联合应用血管内皮细胞生长因子(VEGF165)及血管生成素(ANG-1),对猪慢性缺血心肌中血管生成效应及心功能改善的影响。方法:完全腔镜下放置血管缩窄环于小型猪左冠状动脉回旋支(LCX),建立慢性心肌缺血模型。6周后行心电图、冠状...
目的:探讨联合应用血管内皮细胞生长因子(VEGF165)及血管生成素(ANG-1),对猪慢性缺血心肌中血管生成效应及心功能改善的影响。方法:完全腔镜下放置血管缩窄环于小型猪左冠状动脉回旋支(LCX),建立慢性心肌缺血模型。6周后行心电图、冠状动脉造影和心脏超声检查,确认LCX闭塞或相应心肌的缺血。16只动物随机均分为:单纯注射转染VEGF165组(组Ⅰ,n=4)、单纯注射转染ANG-1组(组Ⅱ,n=4)、联合注射转染VEGF165与ANG-1组(组Ⅲ,n=4)和注射磷酸盐缓冲液PBS对照组(组Ⅳ,n=4)。各组在胸腔镜下,心肌内直接注射rAAV2ANG-1、rAAV2VEGF165,剂量为5×1011vg(virus/genome)。治疗后,不同时间点ELISA检测VEGF165和ANG-1蛋白的分泌,冠状动脉造影观察侧枝循环形成的情况,行心脏超声检查观察左心室功能变化。3个月后取注射部位心肌,用Western blot检测VEGF165和ANG-1蛋白的表达情况,免疫组织化学观察心肌毛细血管密度与微小动脉生成情况。结果:放置血管缩窄环后6周,所有动物均出现LCX完全/次全闭塞,或LCX支配区域的心肌缺血。Ⅰ、Ⅲ两组猪体内的VEGF165蛋白分泌水平从基因转染后第7天开始上升,并于第14天达到高峰,随后逐渐下降,尤以Ⅰ组分泌水平为高;其它两组各时间点及组间的VEGF165蛋白分泌水平差异无统计学意义(P>0.05)。同样,Ⅱ、Ⅲ两组猪体内的ANG-1蛋白分泌水平的变化与VEGF165蛋白分泌水平类似,尤以Ⅱ组分泌水平为高(P<0.01);其它两组各时间点及组间的ANG-1蛋白分泌水平差异无统计学意义;组Ⅲ中VEGF165与ANG-1蛋白水平变化同步。Western blot检测显示,基因治疗后3个月,组ⅢVEGF165、ANG-1蛋白水平都显著高于组Ⅳ(P<0.01),组Ⅲ与组Ⅰ间VEGF165蛋白表达无显著差异(P>0.05),组Ⅲ与组Ⅱ间ANG-1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。基因治疗3个月后,组Ⅲ左心室室腔缩小,心肌收缩力增强,LCX及其分支较基因转染前增粗、迂回,左回旋支发出侧支,左回旋支远端重新有造影剂充填。组Ⅰ、Ⅱ则有不同程度心肌收缩力增强,充盈改善,但均较组Ⅲ改善幅度小,回旋支见少许造影剂充填,但较组Ⅲ明显少,组Ⅳ处理前后无明显改变。超声检查显示,模型建立术后6周,左心室下壁及后壁变薄,局部运动减弱、不协调,收缩异常;基因转染后1个月、3个月,组Ⅰ、组Ⅱ、组Ⅲ心功能都较转染前有明显改善,组Ⅳ无明显变化;组Ⅲ的EF与FS改善程度要明显好于其他各组。CD34免疫组化染色评价血管密度,组Ⅲ缺血区血管计数高于组Ⅰ、组Ⅱ,差异有统计学意义(P<0.05),对照组Ⅳ的心肌内毛细血管数目很少。应用α-SMA免疫组化染色评价小动脉形成,结果提示,基因转染3个月后组Ⅳ心肌中小动脉密度最低,其余各组心肌中均有较多的小动脉新生,尤以组Ⅲ最为显著。结论:完全腔镜下放置血管缩窄环及完成心肌内注射切实可行,在胸腔镜下建立的小型猪慢性心肌缺血模型中,心肌内注射rAAV2VEGF165、rAAV2ANG-1可以有效地转染小型猪心肌组织,外源基因长期稳定表达,同时ANG-1能协同VEGF165作用,从而显著地提高其促进缺血心肌毛细血管和小动脉生成,促进有效侧枝循环形成并改善心功能。
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关键词
心肌缺血/病理学
血管
生成
素
1/遗传学
慢性心肌缺血
腺相关病毒
血管形成素-1
血管
内皮细胞生长因子类/遗传学
血管
新生
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职称材料
题名
复制缺陷的重组腺病毒介导的血管形成素-1基因的制备及其体外表达的研究
1
作者
陈仕林
梅举
程茅薇
徐志云
张宝仁
黄盛东
景华
张石江
机构
南京军区南京总医院胸心外科
第二军医大学长海医院胸心外科
出处
《医学研究生学报》
CAS
2001年第6期471-473,477,共4页
基金
国家自然科学基金资助课题 (批准号 :39970 735 )
文摘
目的 :探讨重组腺病毒载体构建及其在体外的有效转录。 方法 :以RT PCR自人脾组织中克隆和筛选出血管形成素 1(Ang 1)全长cDNA ,测序鉴定正确后 ,经salI酶切并克隆到E1、E3 缺失的Ad5腺病毒载体 (PAxCAwt)中 ,应用cosmid TPC磷酸钙共沉淀法 ,将含有左向转录表达单元重组载体PAxCAwtAng 1与DNA 末端肽复合物(TPC)一同转染 2 93细胞中 ,经挑选克隆、病毒扩增、纯化、浓度滴度测定 ,制备了纯化病毒颗粒 ,以此转染人脐静脉上皮细胞 (ECV30 4) ,收集转染后 17天的细胞 ,用RT PCR检测转染细胞中外源性Ang 1基因转录。 结果 :实验所克隆的Ang 1DNA片段为含有信号肽结构的长度为 15 15bp的全长cDNA ,与文献报道一致。外源基因在转染细胞中能有效转录。 结论 :Ad5 PAxCAwt转导的血管形成素
关键词
血管形成素-1
腺病毒
基因转染
制备
体外表达
Keywords
Ang
1
Adenovirus
Gene transfection
分类号
R392-33 [医药卫生—免疫学]
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职称材料
题名
rAAV_2VEGF_(165)与rAAV_2ANG-1联合转染促猪缺血心肌血管生成的研究
被引量：
3
2
作者
朱成楚
陈仕林
刘玉清
唐礼江
林仙方
包卫光
马德华
朱广球
周文娟
周仪林
杜丛文
机构
浙江省台州医院心胸外科
南京医科大学附属江苏省肿瘤医院胸外科
阜外医院临床心血管药理中心
出处
《浙江大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2010年第6期610-617,共8页
基金
国家人事部博士后基金资助课题(2002032188)
浙江省卫生厅重点资助项目(2005ZD012)
文摘
目的:探讨联合应用血管内皮细胞生长因子(VEGF165)及血管生成素(ANG-1),对猪慢性缺血心肌中血管生成效应及心功能改善的影响。方法:完全腔镜下放置血管缩窄环于小型猪左冠状动脉回旋支(LCX),建立慢性心肌缺血模型。6周后行心电图、冠状动脉造影和心脏超声检查,确认LCX闭塞或相应心肌的缺血。16只动物随机均分为:单纯注射转染VEGF165组(组Ⅰ,n=4)、单纯注射转染ANG-1组(组Ⅱ,n=4)、联合注射转染VEGF165与ANG-1组(组Ⅲ,n=4)和注射磷酸盐缓冲液PBS对照组(组Ⅳ,n=4)。各组在胸腔镜下,心肌内直接注射rAAV2ANG-1、rAAV2VEGF165,剂量为5×1011vg(virus/genome)。治疗后,不同时间点ELISA检测VEGF165和ANG-1蛋白的分泌,冠状动脉造影观察侧枝循环形成的情况,行心脏超声检查观察左心室功能变化。3个月后取注射部位心肌,用Western blot检测VEGF165和ANG-1蛋白的表达情况,免疫组织化学观察心肌毛细血管密度与微小动脉生成情况。结果:放置血管缩窄环后6周,所有动物均出现LCX完全/次全闭塞,或LCX支配区域的心肌缺血。Ⅰ、Ⅲ两组猪体内的VEGF165蛋白分泌水平从基因转染后第7天开始上升,并于第14天达到高峰,随后逐渐下降,尤以Ⅰ组分泌水平为高;其它两组各时间点及组间的VEGF165蛋白分泌水平差异无统计学意义(P>0.05)。同样,Ⅱ、Ⅲ两组猪体内的ANG-1蛋白分泌水平的变化与VEGF165蛋白分泌水平类似,尤以Ⅱ组分泌水平为高(P<0.01);其它两组各时间点及组间的ANG-1蛋白分泌水平差异无统计学意义;组Ⅲ中VEGF165与ANG-1蛋白水平变化同步。Western blot检测显示,基因治疗后3个月,组ⅢVEGF165、ANG-1蛋白水平都显著高于组Ⅳ(P<0.01),组Ⅲ与组Ⅰ间VEGF165蛋白表达无显著差异(P>0.05),组Ⅲ与组Ⅱ间ANG-1蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。基因治疗3个月后,组Ⅲ左心室室腔缩小,心肌收缩力增强,LCX及其分支较基因转染前增粗、迂回,左回旋支发出侧支,左回旋支远端重新有造影剂充填。组Ⅰ、Ⅱ则有不同程度心肌收缩力增强,充盈改善,但均较组Ⅲ改善幅度小,回旋支见少许造影剂充填,但较组Ⅲ明显少,组Ⅳ处理前后无明显改变。超声检查显示,模型建立术后6周,左心室下壁及后壁变薄,局部运动减弱、不协调,收缩异常;基因转染后1个月、3个月,组Ⅰ、组Ⅱ、组Ⅲ心功能都较转染前有明显改善,组Ⅳ无明显变化;组Ⅲ的EF与FS改善程度要明显好于其他各组。CD34免疫组化染色评价血管密度,组Ⅲ缺血区血管计数高于组Ⅰ、组Ⅱ,差异有统计学意义(P<0.05),对照组Ⅳ的心肌内毛细血管数目很少。应用α-SMA免疫组化染色评价小动脉形成,结果提示,基因转染3个月后组Ⅳ心肌中小动脉密度最低,其余各组心肌中均有较多的小动脉新生,尤以组Ⅲ最为显著。结论:完全腔镜下放置血管缩窄环及完成心肌内注射切实可行,在胸腔镜下建立的小型猪慢性心肌缺血模型中,心肌内注射rAAV2VEGF165、rAAV2ANG-1可以有效地转染小型猪心肌组织,外源基因长期稳定表达,同时ANG-1能协同VEGF165作用,从而显著地提高其促进缺血心肌毛细血管和小动脉生成,促进有效侧枝循环形成并改善心功能。
关键词
心肌缺血/病理学
血管
生成
素
1/遗传学
慢性心肌缺血
腺相关病毒
血管形成素-1
血管
内皮细胞生长因子类/遗传学
血管
新生
Keywords
Myocardial ischemia/pathol
Angiopoietin
-
1
/genet
Chronic ischemic myocardium
Adeno
-
associated virus
Vascular endothelial growth factor
Angiogenesis
分类号
R541.4 [医药卫生—心血管疾病]
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职称材料
题名
作者
出处
发文年
被引量
操作
1
复制缺陷的重组腺病毒介导的血管形成素-1基因的制备及其体外表达的研究
陈仕林
梅举
程茅薇
徐志云
张宝仁
黄盛东
景华
张石江
《医学研究生学报》
CAS
2001
0
在线阅读
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职称材料
2
rAAV_2VEGF_(165)与rAAV_2ANG-1联合转染促猪缺血心肌血管生成的研究
朱成楚
陈仕林
刘玉清
唐礼江
林仙方
包卫光
马德华
朱广球
周文娟
周仪林
杜丛文
《浙江大学学报（医学版）》
CAS
CSCD
北大核心
2010
3
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