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产气荚膜梭菌Alpha毒素突变体的表达及单克隆抗体制备
1
作者 韩凤烨 刘莹 +7 位作者 潘晨帆 张乾义 陈小云 朱真 印春生 温永俊 王凤雪 杜吉革 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第1期442-450,共9页
[目的]获得产气荚膜梭菌Alpha毒素(Clostridium perfringens alpha-toxin, CPA)的重组突变体,评价其毒力和抗原性,进而制备针对CPA的单克隆抗体,并评价单克隆抗体特性。[方法]通过人工合成含6个氨基酸突变(第56和130位的天冬氨酸突变为... [目的]获得产气荚膜梭菌Alpha毒素(Clostridium perfringens alpha-toxin, CPA)的重组突变体,评价其毒力和抗原性,进而制备针对CPA的单克隆抗体,并评价单克隆抗体特性。[方法]通过人工合成含6个氨基酸突变(第56和130位的天冬氨酸突变为甘氨酸、第275、307和331位的酪氨酸突变为苯丙氨酸、第336位的天冬氨酸突变为天冬酰胺)的CPA基因片段,并将其克隆至pET-30a(+)载体,转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞进行诱导表达与纯化,获得重组蛋白rCPA_(m6),并检测其毒力与免疫原性。将rCPA_(m6)作为包被抗原建立CPA抗体的间接ELISA检测方法,并用灭活的天然CPA作为免疫原按照常规方法免疫BALB/c小鼠,制备单克隆抗体,对其功能进行鉴定。[结果]重组蛋白rCPA_(m6)在大肠杆菌BL21(DE3)感受态中能够以可溶性和包涵体两种形式表达。毒力测定结果显示,100μg/只rCPA_(m6)攻毒后,小鼠全部存活。免疫原性分析结果显示,1×最小致死量(MLD)的天然CPA攻毒后,对照组小鼠全部死亡,10和20μg/只rCPA_(m6)免疫组小鼠存活率为100%。利用rCPA_(m6)成功建立了CPA抗体的间接ELISA检测方法,并筛选获得4株分泌抗CPA的单克隆抗体杂交瘤细胞株,分别命名为6E3、6B8、10A11、13D10,且4种细胞上清抗体效价均≥1∶3 200,其中单克隆抗体6B8细胞上清能中和天然CPA,且能与rCPA_(m6)发生反应。[结论]试验成功获得具有良好的安全性和免疫原性的重组蛋白rCPA_(m6),制备的CPA单克隆抗体6B8具有一定的中和活性及较高的特异性和敏感性。研究结果为CPA亚单位疫苗的研制提供了候选抗原,同时为CPA中毒症的治疗以及抗原/抗体检测方法的建立提供了物质基础。 展开更多
关键词 产气荚膜梭菌Alpha毒素(CPA) 突变体 原核表达 单克隆抗体
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猪IL-1β单克隆抗体制备及其抗炎症反应活性
2
作者 李璠 孙海凤 +5 位作者 孙萌 高雁怩 孙杨杨 张路捷 白娟 姜平 《畜牧兽医学报》 北大核心 2025年第2期890-899,共10页
IL-1β可介导炎症病理,阻断IL-1活性具有重要抗炎治疗作用。本研究通过构建猪IL-1β原核表达质粒,进行大肠杆菌表达和蛋白纯化,制备重组蛋白。采用细胞杂交瘤技术制备获得4株稳定分泌IL-1β单克隆抗体杂交瘤细胞株(1E2、2H3、5H3及7E7);... IL-1β可介导炎症病理,阻断IL-1活性具有重要抗炎治疗作用。本研究通过构建猪IL-1β原核表达质粒,进行大肠杆菌表达和蛋白纯化,制备重组蛋白。采用细胞杂交瘤技术制备获得4株稳定分泌IL-1β单克隆抗体杂交瘤细胞株(1E2、2H3、5H3及7E7);4株单抗腹水ELISA效价高达1∶1024000;5H3单抗识别的抗原表位为149 DLKREVVFCM 158;1E2、2H3和7E7单抗所识别的抗原表位为202 KRYPKRD 208。脂多糖(LPS)小鼠炎症模型抗炎试验结果显示,相对LPS对照组,IL-1β单抗处理组小鼠血清NO、TNF-α、IL-6和IL-1β含量及临床症状评分显著降低,表明4株单抗均有较好抗炎效果,其中1E2单抗抗炎作用最优,为猪IL-1β阻断药物研究奠定了重要基础。 展开更多
关键词 IL-1Β 单克隆抗体 炎症治疗
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非洲猪瘟病毒p22蛋白单克隆抗体制备及其抗原表位鉴定
3
作者 王小格 司煊瑛 +8 位作者 闫志伟 王飞 尤龙琪 刘梗 蔡茂 梁珺珹 梁玉秀 杜永坤 张改平 《中国畜牧兽医》 北大核心 2025年第2期781-791,共11页
[目的]采用原核表达系统表达并获得非洲猪瘟病毒(ASFV)p22重组蛋白,并进一步制备、鉴定p22重组蛋白的单克隆抗体。[方法]采用PCR方法扩增ASFV p22蛋白编码基因,构建重组表达质粒pET-28a(+)-p22,并通过IPTG诱导表达p22蛋白。将纯化后重... [目的]采用原核表达系统表达并获得非洲猪瘟病毒(ASFV)p22重组蛋白,并进一步制备、鉴定p22重组蛋白的单克隆抗体。[方法]采用PCR方法扩增ASFV p22蛋白编码基因,构建重组表达质粒pET-28a(+)-p22,并通过IPTG诱导表达p22蛋白。将纯化后重组蛋白免疫小鼠,取免疫小鼠脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行融合制备单克隆抗体。通过Western blotting鉴定单克隆抗体特异性,通过ELISA方法测定腹水效价;利用在线软件预测p22蛋白抗原表位分布情况并合成重叠多肽,通过Dot blotting鉴定抗体识别的抗原表位。[结果]本研究成功构建了p22重组蛋白的原核表达质粒,获得原核系统表达的p22重组蛋白,分子质量约为22 ku。用纯化后p22蛋白作为免疫原免疫小鼠,成功筛选到4株阳性单克隆杂交瘤细胞株,分别为1G3D7G11、2G5H6H8、6D10G7D6和8F6F8B9,其腹水效价均达到1∶500 000。Western blotting结果显示,4株单克隆抗体均能与p22蛋白发生特异性反应。单克隆亚型鉴定结果显示,1G3D7G11、2G5H6H8和6D10G7D6株单克隆抗体的重链均为IgG1类,8F6F8B9株单克隆抗体的重链为IgG2a类,4株单克隆抗体轻链均为Kappa型。Dot blotting检测结果显示,1G3D7G11、2G5H6H8株单克隆抗体识别抗原表位位于第58—89位氨基酸处;8F6F8B9株单克隆抗体识别抗原表位位于第126—150位氨基酸处。[结论]本研究成功制备了4株ASFV p22蛋白的单克隆抗体,并初步鉴定了单克隆抗体所识别的B细胞表位区间。研究结果为p22蛋白的生物学功能研究和ASFV血清学检测提供了参考依据。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 p22蛋白 单克隆抗体 抗原表位
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禽白血病病毒p27蛋白单克隆抗体制备及抗原表位的鉴定
4
作者 陈桂娥 容芳 +3 位作者 苟鑫 孙荣航 李作生 陈瑞爱 《动物医学进展》 北大核心 2025年第1期23-28,共6页
为制备禽白血病病毒(ALV)p27蛋白特异性单克隆抗体,利用原核表达系统表达并纯化ALV p27蛋白,将其作为免疫原免疫注射Balb/c小鼠,用杂交瘤细胞融合和ELISA等筛选出阳性单克隆抗体细胞,对制备的单克隆抗体的抗体亚型、效价及特异性进行鉴... 为制备禽白血病病毒(ALV)p27蛋白特异性单克隆抗体,利用原核表达系统表达并纯化ALV p27蛋白,将其作为免疫原免疫注射Balb/c小鼠,用杂交瘤细胞融合和ELISA等筛选出阳性单克隆抗体细胞,对制备的单克隆抗体的抗体亚型、效价及特异性进行鉴定,将目的蛋白截短成4段,初步鉴定单克隆抗体识别的抗原表位区域。结果表明,共筛选出4株单克隆细胞,其抗体亚类皆为IgG1型,其中3A1抗体效价为1∶64000,3B2为1∶256000,5F1为1∶128000,5G2为1∶8000;4株单克隆抗体识别的抗原表位在1-60 aa之间。研究结果为进一步建立ALV相关免疫学检测方法提供了重要的材料。 展开更多
关键词 禽白血病病毒 P27蛋白 单克隆抗体 抗原表位
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不同单克隆抗体聚集与断裂行为的多维分析
5
作者 陆治锦 文玺凯 +5 位作者 刘鲁杰 王宜冰 沈春雷 伍维 沈智勇 赵黎明 《华东理工大学学报(自然科学版)》 北大核心 2025年第1期42-49,共8页
采用尺寸排阻色谱法和分析型超速离心法对ZG154和ZG187抗体的分子大小变异体进行正交分析,系统解析了造成聚集和断裂的因素。结果表明,40℃时ZG154样品在天冬酰胺329位点发生脱酰胺修饰的比例增加了30.7%,通过增加分子间相互作用,相关... 采用尺寸排阻色谱法和分析型超速离心法对ZG154和ZG187抗体的分子大小变异体进行正交分析,系统解析了造成聚集和断裂的因素。结果表明,40℃时ZG154样品在天冬酰胺329位点发生脱酰胺修饰的比例增加了30.7%,通过增加分子间相互作用,相关修饰加速了聚集,并导致断裂的发生;40℃时ZG187样品在蛋氨酸430位点发生氧化修饰的比例增加了36.9%,相关修饰降低了蛋白的稳定性,导致了断裂的发生。研究结果为上述药物研发和生产过程中的聚集与断裂问题提供了检测和分析方法。 展开更多
关键词 单克隆抗体 聚集 断裂 脱酰胺 氧化
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牛冠状病毒单克隆抗体的制备
6
作者 项钰 周玉龙 《黑龙江八一农垦大学学报》 2025年第1期51-56,72,共7页
牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)是引起犊牛肠胃炎的主要病原之一。为获得由天然免疫反应引起的单克隆抗体,采用纯化BCoV蛋白足垫法免疫BALB/c小鼠;采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞;经6~7次亚克隆获得了4株能稳定分泌抗体的... 牛冠状病毒(Bovine coronavirus,BCoV)是引起犊牛肠胃炎的主要病原之一。为获得由天然免疫反应引起的单克隆抗体,采用纯化BCoV蛋白足垫法免疫BALB/c小鼠;采用间接ELISA方法筛选阳性杂交瘤细胞;经6~7次亚克隆获得了4株能稳定分泌抗体的杂交瘤细胞株,分别是5D6、5G5、1B9、1D9;采用腹水法制备大量单克隆抗体,并对腹水效价为1∶6.4×10~5的5D6纯化;最后,利用IFA、抗体亚类鉴定试验、杂交瘤细胞染色体数目检查、Western blot及特异性试验对4株单克隆抗体生物学活性鉴定。结果显示:IFA试验表明4株单克隆抗体均可以与BCoV反应呈特异性红光,制备的4株单克隆抗体轻链均为Kappa链,1D9、5D6、5G5重链为IgG2a,而1B9重链为IgG1;杂交瘤细胞染色体检查结果显示染色体数目在95~110个;Western blot结果显示,单克隆抗体与感染病毒的细胞存在55 kDa的特异性条带,且特异性试验结果表明4株单克隆抗体均不与感染牛传染性鼻气管炎病毒、牛副流感病毒3型及轮状病毒的细胞发生非特异性反应。综上,利用BCoV全病毒制备了4株单克隆抗体,能与BCoV发生特异性反应,生物学活性良好,为BCoV特异性诊断方法的建立及病毒的受体感染机制的研究奠定了基础。 展开更多
关键词 牛冠状病毒 单克隆抗体 病毒浓缩
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微小隐孢子虫cgd8-2500的原核表达及单克隆抗体的制备
7
作者 刘雪芹 于志海 +5 位作者 孙秋艳 李秀 何孟莲 程光民 王光锋 张风荣 《动物医学进展》 北大核心 2025年第3期87-92,共6页
为研究微小隐孢子虫cgd8-2500蛋白质相关生物学特征,通过生物信息学分析,从微小隐孢子虫基因组中筛选I型跨膜蛋白并选取功能未知、大小适中的基因cgd8-2500;对该基因的氨基酸序列预测分析,选取免疫原性且亲水性好的区域进行原核表达重... 为研究微小隐孢子虫cgd8-2500蛋白质相关生物学特征,通过生物信息学分析,从微小隐孢子虫基因组中筛选I型跨膜蛋白并选取功能未知、大小适中的基因cgd8-2500;对该基因的氨基酸序列预测分析,选取免疫原性且亲水性好的区域进行原核表达重组蛋白质;利用重组蛋白免疫Balb/c小鼠,制备针对该蛋白的单克隆抗体。结果表明,PCR成功扩增423 bp目的片段,连接T载体,酶切后连至表达载体pET-28a,并获得高纯度蛋白质,免疫Balb/c小鼠后,获得针对cgd8-2500的单克隆抗体。该研究获得了免疫用重组蛋白,进而获得针对cgd8-2500蛋白单克隆抗体,为后期研究其相关生物学特征及其功能提供了工具。 展开更多
关键词 微小隐孢子虫 重组蛋白cgd8-2500 单克隆抗体
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转铁蛋白受体单克隆抗体纳米载药系统在白血病靶向治疗中的应用研究
8
作者 韩海娜 王敏阁 《中国医学工程》 2025年第2期54-58,共5页
目的 观察转铁蛋白受体单克隆抗体(TfR mAb)纳米载药系统辅助靶向治疗白血病的临床效果。方法 该次研究为前瞻性研究,选取2020年5月至2022年12月期间商丘市第一人民医院收治的白血病患者中随机抽取85例,分组方式为电脑随机分组法,将入... 目的 观察转铁蛋白受体单克隆抗体(TfR mAb)纳米载药系统辅助靶向治疗白血病的临床效果。方法 该次研究为前瞻性研究,选取2020年5月至2022年12月期间商丘市第一人民医院收治的白血病患者中随机抽取85例,分组方式为电脑随机分组法,将入组患者分别列为靶向组(42例)和联合组(43例),两组患者均接受靶向治疗,联合组采用TfR mAb纳米载药系统辅助靶向治疗,所有患者开展为期1年随访,比较两组患者的近期疗效及短期预后情况。结果 在不同治疗方案下,联合组治疗7 d、14 d、21 d后的人早幼粒白血病细胞(HL-60)凋亡率分别为(20.45±5.18)%、(23.36±5.47)%、(26.33±5.45)%,均高于靶向组[(18.45±3.23)%、(20.47±5.11)%、(23.44±5.23)%](P<0.05);联合组的总缓解率[86.05%(37/43)]高于靶向组[66.67%(28/42)](P<0.05);联合组的T淋巴细胞亚群CD3^(+)、CD4^(+)、CD4^(+)/CD8^(+)表达水平分别为(65.75±10.33)%、(70.24±10.31)%、(1.77±0.26),均高于靶向组[(60.35±10.44)%、(65.22±10.38)%、(1.24±0.72)](P<0.05);随访期间,联合组的中位无进展生存期(PFS)、中位总生存期(OS)分别为(9.36±1.45)个月、(10.41±2.25)个月,均高于靶向组[(8.41±1.25)个月、(9.33±1.72)个月](P<0.05);1年内病情复发率及死亡率分别为6.98%(3/43)、2.33%(1/43),均低于靶向组[28.57%(12/42)、21.43%(9/42)](P<0.05)。结论 TfR mAb纳米载药系统能增强白血病患者的靶向治疗效果,对促进HL-60细胞凋亡、改善机体免疫功能、延长患者生存周期并降低病情复发或死亡风险均有重要意义。 展开更多
关键词 白血病 转铁蛋白受体单克隆抗体 纳米载药系统 细胞凋亡率 预后情况
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抗鸡传染性贫血病毒VP2蛋白单克隆抗体的制备及其应用研究
9
作者 侯力丹 薛麒 +8 位作者 王嘉 孔冬妮 吴宏举 翟天舒 邓永 毛娅卿 吴华伟 孙瑶 刘丹 《中国兽药杂志》 2024年第8期1-8,共8页
为制备针对鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)的单克隆抗体,以CIAV的VP2原核表达蛋白作为抗原免疫小鼠,经杂交瘤技术获得3株能稳定分泌抗VP2蛋白特异性抗体的细胞株,进一步经IFA筛选出特异性和灵敏度俱佳的杂交... 为制备针对鸡传染性贫血病毒(Chicken infectious anemia virus,CIAV)的单克隆抗体,以CIAV的VP2原核表达蛋白作为抗原免疫小鼠,经杂交瘤技术获得3株能稳定分泌抗VP2蛋白特异性抗体的细胞株,进一步经IFA筛选出特异性和灵敏度俱佳的杂交瘤细胞Mab-VP2-4株,制备的小鼠腹水效价达到1∶2000。结果显示,制备的抗VP2蛋白单克隆抗体可与多株CIAV感染的MDCC-MSB1细胞发生特异性反应,而对EDSV、ALV、ILTV、ARV以及空白MDCC-MSB1细胞、CEF细胞等均无交叉反应,特异性良好,且应用于IFA方法时对CIAV感染的最低检出限为5 TCID 50。以该单克隆抗体对市场上10种不同来源的禽活疫苗进行病毒分离结合单克隆抗体IFA检测,同时与《中国兽药典》规定的鸡检查法进行对比检测,结果一致,均未检出CIAV污染。本研究制备了针对CIAV VP2蛋白的特异性单克隆抗体,为该病特异性诊断方法的建立奠定了基础。 展开更多
关键词 鸡传染性贫血病毒 VP2蛋白 单克隆抗体 间接免疫荧光
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牛支原体NM001株单克隆抗体的制备与鉴定
10
作者 刘莹 王静文 +3 位作者 张敏 陈小云 王磊 杨承槐 《中国兽药杂志》 2024年第2期34-39,共6页
为获得抗牛支原体NM001株单克隆抗体,并评价其特性,以牛支原体分离株NM001作为抗原免疫6周龄BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术和间接ELISA方法筛选到2株能稳定分泌抗牛支原体的单克隆抗体细胞,命名为2C5和7G3。其细胞上清的间接ELISA抗体效价... 为获得抗牛支原体NM001株单克隆抗体,并评价其特性,以牛支原体分离株NM001作为抗原免疫6周龄BALB/c小鼠,利用杂交瘤技术和间接ELISA方法筛选到2株能稳定分泌抗牛支原体的单克隆抗体细胞,命名为2C5和7G3。其细胞上清的间接ELISA抗体效价分别为6.4×10^(3)和1.2×10^(4)。经亚型测定,单抗2C5和7G3均属于IgG1类,轻链均是λ型。制备腹水并对单抗进行纯化和特性鉴定,两株单抗的间接ELISA抗体效价分别为1.02×10^(5)和4.09×10^(5),且两株单抗与无乳支原体、山羊支原体山羊肺炎亚种、丝状支原体山羊亚种、绵羊肺炎支原体、牛巴氏杆菌均无交叉反应。Western Blot结果显示,2株单抗均能特异性识别牛支原体全菌蛋白中的相应蛋白。试验表明,单抗2C5和7G3能够与牛支原体发生特异性反应,从而为牛支原体血清学检测提供一定的物质基础。 展开更多
关键词 牛支原体 单克隆抗体 特异性
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抗白细胞介素-5单克隆抗体治疗哮喘效果的Meta分析
11
作者 赵惠敏 李秀业 +3 位作者 刘领 杨霁 吴文杰 薛兵 《中国社区医师》 2024年第13期36-38,共3页
目的:系统评价抗白细胞介素-5(IL-5)单克隆抗体治疗哮喘的临床效果。方法:在PubMed、Embase和Cochrane对照试验中央注册中心检索有关抗IL-5单克隆抗体治疗哮喘的随机对照试验文献,检索时间为截至2024年3月,对数据采用CMA 2.0软件进行Met... 目的:系统评价抗白细胞介素-5(IL-5)单克隆抗体治疗哮喘的临床效果。方法:在PubMed、Embase和Cochrane对照试验中央注册中心检索有关抗IL-5单克隆抗体治疗哮喘的随机对照试验文献,检索时间为截至2024年3月,对数据采用CMA 2.0软件进行Meta分析。结果:纳入21篇文献,共8717例患者,试验组4593例,对照组4124例。Meta分析结果显示,在第1秒用力呼气容积(FEV1)、哮喘生活质量问卷评分、不良事件发生情况方面,试验组优于对照组。结论:抗IL-5单克隆抗体治疗哮喘的临床效果较好,可改善患者FEV1、生活质量,且安全性较高。 展开更多
关键词 抗白细胞介素-5 哮喘 单克隆抗体 META分析
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猪圆环病毒3型Cap蛋白单克隆抗体的制备及阻断ELISA检测方法的建立 被引量：1
12
作者 张宝戈 黄雅琴 +2 位作者 蔡金双 朱晨光 李玉峰 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第3期1170-1178,共9页
旨在建立检测猪圆环病毒3型(PCV3)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的PCV3Cap重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得了一株分泌阻断效果良好抗体的杂交瘤细胞株2E6。以重组Cap蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的2E6单克隆... 旨在建立检测猪圆环病毒3型(PCV3)抗体的阻断ELISA方法,本研究利用原核表达的PCV3Cap重组蛋白免疫BALB/c小鼠制备获得了一株分泌阻断效果良好抗体的杂交瘤细胞株2E6。以重组Cap蛋白作为包被抗原,以辣根过氧化物酶(HRP)标记的2E6单克隆抗体作为检测抗体,经条件优化后建立了一种检测PCV3抗体的阻断ELISA方法。用建立的阻断ELISA方法检测50份临床阴性血清,计算阻断率(PI)的临界值,以此来确定该方法的判定标准:当PI≤28.30%时,判定结果为阴性;当PI≥35.05%时,判定结果为阳性;当28.30%<PI<35.05%时,判定为可疑,重复一次试验后如果结果仍为可疑,则判定为阳性。特异性试验表明该方法与猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)以及猪瘟病毒(CSFV)的阳性血清均无交叉反应;敏感性试验表明其检测效价可达到1:128;重复性试验表明批内与批间的变异系数均小于10%;符合性检验表明该方法与PCV检测金标准免疫过氧化物酶单层试验(IPMA)比对的Kappa值达0.9,具有高度的一致性。综上所述,本研究建立的阻断ELISA方法具有良好的特异性与较高的符合率,可用于后期进行PCV3抗体的检测,为PCV3的流行病学调查与临床诊断提供技术支持。 展开更多
关键词 猪圆环病毒3型 Cap重组蛋白 单克隆抗体 阻断ELISA
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猫杯状病毒VP1蛋白的单克隆抗体制备及抗原表位鉴定
13
作者 张泽宇 董宁宁 +5 位作者 谈晓梅 李传锋 朱杰 刘光清 张伟 孟春春 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第12期5784-5791,共8页
本研究旨在制备并鉴定针对猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV)VP1蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibodies,mAbs)。本研究使用SH14株FCV全病毒作为免疫原,通过腹腔注射法免疫BALB/c小鼠,制备了针对VP1蛋白的mAb。通过ELISA筛选,成功获... 本研究旨在制备并鉴定针对猫杯状病毒(feline calicivirus,FCV)VP1蛋白的单克隆抗体(monoclonal antibodies,mAbs)。本研究使用SH14株FCV全病毒作为免疫原,通过腹腔注射法免疫BALB/c小鼠,制备了针对VP1蛋白的mAb。通过ELISA筛选,成功获得特异性单克隆抗体3A3C1株。对3A3C1株mAb进行了全面的生物学特性鉴定,3A3C1株mAb确认为IgG_(1)型,轻链为κ链。Western blot和间接免疫荧光检测的结果显示,3A3C1株mAb能特异性地识别并结合FCV SH14株、F9株和GZ22。此外,本研究还深入探究了3A3C1株mAb的线性抗原表位。通过分段表达VP1蛋白并进行详细的Western blot分析,最终确定3A3C1株mAb的线性抗原表位位于VP1蛋白的^(426)PSRLTPAGDYAITSG^(440)区域。本研究制备的3A3C1株mAb不仅是理解FCV免疫学特性的重要工具,也对发展FCV诊断方法和疫苗策略具有潜在应用价值。 展开更多
关键词 猫杯状病毒 单克隆抗体 抗原表位 衣壳蛋白
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基因Ⅳ型禽呼肠孤病毒σC蛋白单克隆抗体的制备及功能鉴定
14
作者 高金慧 王素艳 +8 位作者 刘芮 祁小乐 陈运通 张艳萍 崔红玉 刘永振 段雨路 高立 高玉龙 《中国动物检疫》 CAS 2024年第8期98-104,共7页
为制备基因Ⅳ型(GCⅣ)禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)σC蛋白单克隆抗体,构建了重组原核表达质粒pCold-I-ARV-GCⅣ-σC,将重组质粒导入感受态细胞BL21(DE3)中进行蛋白诱导表达;随后将纯化后的σC蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技... 为制备基因Ⅳ型(GCⅣ)禽呼肠孤病毒(avian reovirus,ARV)σC蛋白单克隆抗体,构建了重组原核表达质粒pCold-I-ARV-GCⅣ-σC,将重组质粒导入感受态细胞BL21(DE3)中进行蛋白诱导表达;随后将纯化后的σC蛋白免疫BALB/c小鼠,通过细胞融合技术制备杂交瘤细胞,利用间接酶联免疫吸附试验(ELISA)筛选获得阳性杂交瘤细胞;以间接免疫荧光(IFA)和蛋白免疫印迹(Western blot)试验鉴定杂交瘤细胞后,将杂交瘤细胞株通过腹腔注射小鼠制备单克隆抗体腹水,以ELISA测定腹水效价。结果显示:成功筛选出一株分泌ARV GCⅣσC蛋白单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞株(1H4);制备的单克隆抗体能与ARV GCⅣσC蛋白发生反应,同时与感染不同基因型ARV的鸡肝癌细胞(LMH)均有良好的反应性;该单克隆抗体识别重链为IgG1,其腹水ELISA效价为1:256000。结果表明,成功制备ARV GCⅣσC蛋白单克隆抗体,其效价高,反应性良好,为进一步研究σC蛋白功能、ARV致病机理以及建立临床诊断方法奠定了基础。 展开更多
关键词 禽呼肠孤病毒 基因Ⅳ型 σC蛋白 单克隆抗体 功能鉴定
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抗鸡早幼粒细胞白血病蛋白单克隆抗体的制备及其在荧光检测中的应用
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作者 曹梦瑶 王晶 +5 位作者 周林宜 程晶 李永清 许健 江波 胡格 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第10期4500-4509,共10页
【目的】探究鸡早幼粒细胞白血病蛋白核小体(PML NBs)在马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)感染过程中的生物学功能,制备抗鸡早幼粒细胞白血病蛋白(Ch-PML)单克隆抗体,建立可视化检测Ch-PML的方法。【方法】通过原核表达系统制备... 【目的】探究鸡早幼粒细胞白血病蛋白核小体(PML NBs)在马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)感染过程中的生物学功能,制备抗鸡早幼粒细胞白血病蛋白(Ch-PML)单克隆抗体,建立可视化检测Ch-PML的方法。【方法】通过原核表达系统制备Ch-PML重组蛋白,并将其作为免疫原免疫BALB/c小鼠,采用细胞融合技术将骨髓瘤细胞和免疫小鼠的脾细胞进行融合,用ELISA方法筛选出分泌特异性抗体的杂交瘤细胞株,通过体内诱生法制备腹水并用Protein A/G纯化抗Ch-PML单克隆抗体,利用Western blotting和ELISA方法检测单克隆抗体的特异性、亲和力和亚类,最后利用该单克隆抗体建立用于鸡PML NBs的间接免疫荧光试验(IFA)检测方法。【结果】Ch-PML蛋白在大肠杆菌中可溶性表达,分子质量大小为19 ku;以此蛋白成功制备了1株抗Ch-PML单克隆抗体,该抗体具有良好的特异性和高亲和力,经亚类和型检测,其为IgG2b亚类,轻链为Kappa型。利用制备的抗Ch-PML单克隆抗体建立的IFA检测方法发现,内源性PML NBs在宿主细胞核中呈点状分布,过表达的Ch-PML在宿主细胞核中形成团块状聚集体,且MDV感染宿主细胞后核内PML NBs数量比未感染细胞显著减少(P<0.05),说明MDV感染导致核内的PML NBs组装受到抑制。【结论】本研究利用制备的抗Ch-PML单克隆抗体建立了鸡PML NBs的IFA检测方法,并发现MDV抑制宿主细胞PML NBs组装这一现象,为MDV致病机制的解析提供了新的研究思路和工具。 展开更多
关键词 早幼粒细胞白血病蛋白(PML) 单克隆抗体 核小体(NBs) 马立克病病毒(MDV)
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犬PD-1单克隆抗体的筛选与鉴定
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作者 王卓 徐司雨 +8 位作者 夏兴霞 李志敏 毕振威 钱晶 莫菲 诸玉梅 王永山 孙树民 谭业平 《中国兽药杂志》 2024年第5期10-16,共7页
为筛选犬程序性死亡受体1(cPD-1)单克隆抗体,以原核表达并纯化复性的cPD-1胞外区蛋白为靶抗原免疫BALB/c小鼠,应用单克隆抗体杂交瘤细胞技术和间接ELISA方法,经3轮轮筛选和克隆化,获得1株能稳定分泌抗cPD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F9... 为筛选犬程序性死亡受体1(cPD-1)单克隆抗体,以原核表达并纯化复性的cPD-1胞外区蛋白为靶抗原免疫BALB/c小鼠,应用单克隆抗体杂交瘤细胞技术和间接ELISA方法,经3轮轮筛选和克隆化,获得1株能稳定分泌抗cPD-1单克隆抗体的杂交瘤细胞株1F9。间接ELISA检测显示1F9杂交瘤细胞株连续传代培养能稳定分泌单克隆抗体,效价达到1∶2048,亚型鉴定重链为IgG1,轻链为κ;以HEK293细胞表达cPD-1胞外区蛋白为检测抗原,Western-blot和间接免疫荧光试验进行鉴定,结果显示1F9单克隆抗体能特异性结合cPD-1胞外区蛋白。本研究通过小鼠杂交瘤技术成功筛选到1株鼠源cPD-1单克隆抗体。 展开更多
关键词 犬 PD-1 单克隆抗体 肿瘤
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鸡γ-干扰素的原核表达及其单克隆抗体制备与鉴定
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作者 崔锦蔷 程晶 +4 位作者 江波 周林宜 刘文晓 李永清 宋勤叶 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第7期3008-3019,共12页
【目的】通过原核表达系统表达鸡γ-干扰素(chicken interferon-gamma,ChIFN-γ),并制备其单克隆抗体,为建立检测天然ChIFN-γ的免疫学方法提供试验材料。【方法】将密码子优化的ChIFN-γ基因克隆至原核表达载体pET-21a(+)中,构建重组质... 【目的】通过原核表达系统表达鸡γ-干扰素(chicken interferon-gamma,ChIFN-γ),并制备其单克隆抗体,为建立检测天然ChIFN-γ的免疫学方法提供试验材料。【方法】将密码子优化的ChIFN-γ基因克隆至原核表达载体pET-21a(+)中,构建重组质粒pET21a-ChIFN-γ;重组质粒转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞后,利用IPTG诱导表达重组蛋白;用该纯化的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,将免疫合格的小鼠脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)融合;用建立的ELISA方法筛选分泌针对ChIFN-γ蛋白特异性抗体的杂交瘤细胞,并制备腹水,Protein A/G纯化腹水获得特异性抗体;对单克隆抗体的类和亚类进行鉴定;Western blotting和间接免疫荧光试验(indirect immunofluorescence assay,IFA)检测单克隆抗体的反应性、亲和力和特异性交叉反应;用辣根过氧化物酶标记单克隆抗体,用两两配对的方法进行抗体配对。【结果】成功制备可溶性重组ChIFN-γ蛋白;Western blotting结果显示,ChIFN-γ与相应抗体结合呈现特异性条带(16 ku);获得7株针对ChIFN-γ的特异性杂交瘤细胞株:3E8、5F8、2G12、5A10、3D8、3B5、3G2。Western blotting和IFA结果显示,7株单克隆抗体反应性良好,均能特异性识别真核表达的ChIFN-γ;单克隆抗体的类和亚类鉴定结果显示,3E8、5F8、3D8、3B5和2G12重链均为IgG1,5A10重链为IgG2a,3G2重链为IgM,7株单克隆抗体的轻链均为Kappa型;所获得的7株单克隆抗体解离常数(dissociation constant,Kd)在1.04~58.33 nmol/L之间,为高亲和力抗体,并获得5组配对抗体。【结论】本研究成功制备了ChIFN-γ蛋白及其单克隆抗体,为进一步开展ChIFN-γ在禽类免疫学、病毒学及疫苗效果评价等相关研究奠定基础。 展开更多
关键词 鸡γ-干扰素 单克隆抗体 亲和力 抗体配对
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非洲猪瘟病毒D1133 L蛋白单克隆抗体抑制其复制
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作者 闫文倩 侯景 +12 位作者 杨金柯 郝雨 杨行 史喜绢 张大俊 别鑫恬 陈国辉 陈玲玲 何路 赵美玉 赵思越 郑海学 张克山 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第2期854-859,共6页
旨在探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)D1133L单克隆抗体对病毒复制的调控效应。在制备了ASFV D1133L单克隆抗体的基础上,将ASFV和不同浓度的单克隆抗体同时接种于PAMs,通过红细胞吸附试验(HAD 50)、实时荧光定量PCR(RT... 旨在探究非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)D1133L单克隆抗体对病毒复制的调控效应。在制备了ASFV D1133L单克隆抗体的基础上,将ASFV和不同浓度的单克隆抗体同时接种于PAMs,通过红细胞吸附试验(HAD 50)、实时荧光定量PCR(RT-qPCR)、蛋白质印迹(Western blot)和荧光观察分析D1133L单克隆抗体对病毒复制的影响。结果显示:不同浓度的单克隆抗体在不同的感染时间对ASFV的病毒效价(P<0.01),蛋白表达水平,基因转录水平(P<0.01),ASFV-GFP绿色荧光蛋白的表达水平(P<0.05)均有显著抑制,且这种抑制作用具有剂量依赖性。综上所述,D1133L单克隆抗体可显著抑制ASFV的复制,试验结果在ASFV药物靶点的选择上具有一定的参考意义。 展开更多
关键词 非洲猪瘟病毒 D1133 L蛋白 单克隆抗体
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牛早幼粒细胞白血病蛋白的原核表达及单克隆抗体制备
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作者 程晶 陈沛霖 +6 位作者 郭禹 崔锦蔷 江波 周林宜 刘文晓 李焕荣 李永清 《中国畜牧兽医》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期4014-4024,共11页
【目的】牛早幼粒细胞白血病蛋白(promyelocytic leukemia protein,PML)是细胞核亚结构PML核体(nuclear bodies,NBs)的骨架蛋白,在抗病毒内源性免疫中发挥重要作用。本研究旨在制备牛PML单克隆抗体,为研究PML NBs结构和功能准备物质材... 【目的】牛早幼粒细胞白血病蛋白(promyelocytic leukemia protein,PML)是细胞核亚结构PML核体(nuclear bodies,NBs)的骨架蛋白,在抗病毒内源性免疫中发挥重要作用。本研究旨在制备牛PML单克隆抗体,为研究PML NBs结构和功能准备物质材料。【方法】构建表达bPML基因截短体的重组质粒pET-32a-bPML,将重组质粒转化大肠杆菌Transetta(DE3)感受态细胞,IPTG诱导表达,利用SDS-PAGE和Western blotting对表达产物进行分析。将经镍柱亲和层析纯化后的重组蛋白免疫小鼠,制备单克隆抗体,应用ELISA方法鉴定单克隆抗体类/亚类和型,进一步鉴定该单克隆抗体识别的抗原表位;通过检测不同种属来源的细胞检测单克隆抗体的特异性;利用该单克隆抗体对外源转染牛PML的细胞进行Western blotting和间接免疫荧光试验(IFA)检测;利用该单克隆抗体建立的IFA检测不同的牛源细胞内源PML定位情况。【结果】牛PML在大肠杆菌中可溶性表达,分子质量大小为50 ku;以此纯化蛋白为免疫原制备出1株抗牛PML单克隆抗体bPML-2G5,其为IgG1亚类,轻链为Kappa型,识别表位位于牛PML结构域78 EQPRPSTSRA 88;Western blotting和IFA分析结果显示,bPML-2G5不仅可特异性识别外源转染的牛PML,而且还能特异性识别牛肾细胞、牛鼻甲骨细胞、牛胚气管细胞的胞核内核体结构中的PML。【结论】本研究成功制备了1株分泌牛PML单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其分泌的单克隆抗体可用于检测外源性及内源性表达的牛PML。 展开更多
关键词 牛早幼粒细胞白血病蛋白 原核表达 蛋白纯化 单克隆抗体
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产单核细胞李氏杆菌内化素G单克隆抗体的制备及双抗体夹心ELISA方法的建立
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作者 马金锐 史文静 +8 位作者 田常青 董志杰 赵学慧 芝吉 曹青 魏衍全 宋维丽 薛惠文 苟惠天 《畜牧兽医学报》 CAS CSCD 北大核心 2024年第9期4069-4076,共8页
本研究旨在建立一种快速检测产单核细胞李氏杆菌的方法。通过PCR扩增产单核细胞李氏杆菌(LM)内化素G(InlG)基因,构建pET-32a-InlG重组表达载体,通过诱导表达获得InlG重组蛋白,将其纯化后免疫小鼠(100μg·只^(-1)),经细胞融合、克... 本研究旨在建立一种快速检测产单核细胞李氏杆菌的方法。通过PCR扩增产单核细胞李氏杆菌(LM)内化素G(InlG)基因,构建pET-32a-InlG重组表达载体,通过诱导表达获得InlG重组蛋白,将其纯化后免疫小鼠(100μg·只^(-1)),经细胞融合、克隆和筛选共获得了3株阳性杂交瘤细胞株,分别命名为1D2、1D2-1和2H10。经鉴定,其分泌抗体亚型均为IgG 1。利用制备的1D2-1作为捕获抗体,产单核细胞李氏杆菌兔多抗作为检测抗体,初步建立检测产单核细胞李氏杆菌的双抗体夹心ELISA方法。Western blot结果显示3株单克隆抗体(mAb)与InlG均可发生特异性反应。双抗体夹心ELISA方法的特异性试验结果显示,与沙门菌、大肠杆菌、枯草杆菌、白色葡萄球菌和柠檬色葡萄球菌均不发生反应。灵敏度试验结果显示,该方法检测LM纯培养物的检测限为1.0×10^(6)CFU·mL^(-1)。重复性试验结果显示,各组变异系数在5%~10%之间(<10%)。综上,本研究利用抗内化素G蛋白的mAb和兔多抗建立了双抗体夹心ELISA方法,该方法具有良好的特异性、敏感性和重复性,可用于产单核细胞李氏杆菌感染的快速诊断检测。 展开更多
关键词 产单核细胞李氏杆菌 内化素G 单克隆抗体 酶联免疫吸附试验
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